Antes do CRISPR/Cas9 se tornar a plataforma dominante de edição genômica, os TALENs e as ZFNs eram as principais ferramentas para modificação genômica direcionada. Ambos usam um domínio de ligação ao DNA modular fusionado ao domínio endonuclease de FokI.

Nucleases de Dedo de Zinco

Uma ZFN consiste em 3–6 módulos de dedo de zinco, cada um reconhecendo 3–4 pb de DNA. Dois monômeros de ZFN se ligam a sítios adjacentes com um espaçador de 5–7 pb entre eles. FokI precisa dimerizar para cortar o DNA, portanto apenas o complexo ZFN-FokI pareado cria uma quebra de fita dupla.

Os módulos de dedo de zinco não são verdadeiramente modulares: a especificidade de cada dedo é influenciada por seus vizinhos, tornando o design de ZFNs difícil. A maioria das ZFNs deve ser selecionada de grandes bibliotecas combinatórias ou projetada usando plataformas proprietárias (Sangamo Biosciences). Essa complexidade limitou a adoção de ZFNs apesar de seu sucesso em ensaios terapêuticos iniciais (SB-728-T para HIV, fase 1).

TALENs

Os TALENs usam o domínio de ligação ao DNA de efetores TAL da bactéria Xanthomonas. Cada repetição TAL reconhece um único nucleotídeo através de dois resíduos de aminoácidos hipervariáveis (o dirresíduo variável de repetição, RVD). O código é simples e previsível:

• HD → C
• NG → T
• NI → A
• NN → G ou A
• NH → G (maior especificidade)

Um arranjo TALEN típico tem 12–20 repetições visando uma sequência de 12–20 pb. Como as ZFNs, os TALENs são usados como um par flanqueando um espaçador de 12–20 pb, com os domínios FokI dimerizando através do espaçador.

A montagem de TALEN é modular, cada repetição é uma peça padronizada, e métodos como a clonagem Golden Gate (MoClo, Golden TALEN, FLASH) permitem a montagem de arranjos TALEN a partir de módulos de repetição pré-fabricados.

Comparação com CRISPR/Cas9

Os TALENs oferecem a taxa mais baixa de efeitos fora do alvo das três plataformas porque o sítio alvo é mais longo e cada repetição TAL se liga a um único nucleotídeo. No entanto, o grande tamanho de cada monômero TALEN (~3 kb) dificulta a entrega em vetores AAV. As ZFNs são pequenas o suficiente para o empacotamento em AAV, mas são difíceis de projetar internamente.

Aplicações

ZFNs e TALENs ainda são usados em aplicações onde o corte fora do alvo deve ser absolutamente minimizado (por exemplo, edição terapêutica em células-tronco) ou onde os requisitos de PAM do CRISPR são restritivos. Os TALENs não têm requisito de PAM e podem alvejar qualquer sequência, incluindo sequências sem PAM NGG.