Para além da edição básica com CRISPR/Cas9, a engenharia genómica inclui rastreio funcional em pool e nucleases alternativas para modificação precisa de sequências.

CRISPR Screening

O CRISPR screening é um método de genómica funcional de alto rendimento que usa bibliotecas lentivirais em pool de single-guide RNAs (sgRNAs) para eliminar cada gene no genoma e identificar os envolvidos num fenótipo de interesse.

Um rastreio típico:

1. Uma biblioteca lentiviral de sgRNA (ex.: biblioteca Brunello: 4 sgRNAs por gene, 77000 sgRNAs no total) é transduzida em células que expressam Cas9 a uma baixa multiplicidade de infeção (~0,3) para garantir que a maioria das células recebe um sgRNA.
2. As células são submetidas a uma pressão de seleção: tratamento com fármaco, exposição a toxinas ou um fenótipo baseado em separação (ex.: um repórter para uma via de sinalização).
3. O DNA genómico é extraído, e as sequências de sgRNA são amplificadas por PCR e quantificadas por sequenciação de nova geração.
4. sgRNAs depletados ou enriquecidos no grupo tratado em comparação com o controlo identificam genes essenciais para a sobrevivência ou resistência.

Os rastreios CRISPR são mais sensíveis e específicos que os rastreios de shRNA porque a Cas9 cria knockouts completos e tem menos efeitos fora do alvo.

TALENs

As nucleases efetoras do tipo ativador de transcrição (TALENs) são enzimas de restrição artificiais feitas pela fusão de um domínio de ligação ao DNA efetor TAL ao domínio nuclease de FokI. Cada repetição do efetor TAL reconhece um par de bases de DNA, permitindo a montagem modular de domínios de ligação que alvejam qualquer sequência.

O domínio FokI deve dimerizar, pelo que os TALENs são usados em pares flanqueando o sítio alvo. A dimerização cria uma quebra de cadeia dupla (DSB) no alvo, que é reparada por junção de extremidades não homólogas (NHEJ) — produzindo pequenas inserções ou deleções — ou por reparo direcionado por homologia (HDR) se for fornecida uma matriz de reparo.

Os TALENs são mais específicos que os primeiros sistemas CRISPR, mas mais trabalhosos de construir porque cada novo alvo requer a montagem de uma nova série de repetições.

Nucleases de Dedo de Zinco (ZFNs)

As ZFNs fundem domínios de dedo de zinco (cada um reconhecendo ~3 pb) ao domínio nuclease de FokI. Como os TALENs, requerem sítios de ligação emparelhados e dimerização de FokI para atividade. As ZFNs foram as primeiras nucleases direcionadas amplamente usadas, mas foram largamente suplantadas pelo CRISPR e TALENs devido à dificuldade de engenharia de arranjos de dedos de zinco com alta especificidade.

Escolhendo uma Abordagem

• CRISPR é o mais simples e escalável — adequado para rastreios em todo o genoma e edição rotineira.
• TALENs oferecem menor edição fora do alvo e são preferidos quando é necessário reconhecimento preciso de base única ou quando a edição em organismos onde as restrições PAM do CRISPR são limitantes.
• ZFNs permanecem úteis em contextos específicos, como terapia genética (onde o tamanho menor ajuda no empacotamento viral) e em organismos onde as outras ferramentas são menos desenvolvidas.