Visão geral
A montagem do transcriptoma é a reconstrução computacional de sequências transcritas expressas a partir de leituras de RNA-seq, realizadas com ou sem um genoma de referência. Para organismos sem um genoma sequenciado, a montagem do transcriptoma de novo é a única opção, fornecendo a primeira visão do potencial de codificação de um organismo. Mesmo quando um genoma de referência está disponível, a montagem do transcriptoma pode capturar novas isoformas, transcrições de fusão e sequências de regiões genômicas mal montadas. O transcriptoma montado serve como base para análises posteriores, incluindo quantificação de expressão, anotação funcional e estudos comparativos.
Métodos
A montagem do transcriptoma De novo usa algoritmos de montagem projetados para cobertura desigual e emenda alternativa. Ferramentas populares incluem Trinity, que usa uma abordagem de gráfico de De Bruijn com vários tamanhos k-mer; rnaSPADEs, adaptado da montagem do genoma; e SOAPdenovo-Trans. Essas ferramentas montam leituras em contigs que representam fragmentos de transcrição, depois agrupam contigs relacionados em grupos de isoformas e resolvem transcrições completas. Montadores guiados por referência (StringTie, Cufflinks) aproveitam alinhamentos com reconhecimento de emenda ao genoma e montam leituras sobrepostas em modelos de transcrição. As principais métricas de qualidade incluem integridade da montagem (pontuações BUSCO em relação a ortólogos conservados), comprimento N50 e número de transcrições completas recuperadas. Redução de redundância usando clusters CD-HIT ou Corset transcrições altamente semelhantes.
Aplicativos
A montagem do transcriptoma permite a descoberta de genes em organismos não-modelo, desde culturas agrícolas até espécies marinhas subexploradas. Ele identifica genes diferencialmente expressos, isoformas específicas de tecidos e transcrições de fusão no câncer. A técnica é essencial quando os dados de sequenciamento de RNA vêm de organismos sem referência e se integra profundamente aos fluxos de trabalho de sequenciamento de próxima geração. Os transcriptomas montados também contribuem para estudos evolutivos, permitindo comparações entre espécies de estrutura e tipos de RNA. À medida que o sequenciamento de leitura longa (Iso-Seq, Oxford Nanopore) melhora, as estratégias de montagem híbrida que combinam leituras curtas e longas estão produzindo transcriptomas mais completos e precisos do que nunca.
Protocolo Prático
Para a montagem do transcriptoma de novo com Trinity, primeiro certifique-se de que as leituras de RNA-seq tenham sido submetidas a corte de qualidade com Trimmomatic. Execute Trinity com o comando: Trinity --seqType fq --max_memory 50G --CPU 8 --left reads_R1.fastq --right reads_R2.fastq --output trinity_out_dir. Trinity opera em três módulos: Inchworm monta gráficos k-mer em contigs, Chrysalis agrupa contigs em gráficos de Bruijn representando variantes de transcrição completas e Butterfly traça caminhos através desses gráficos para reconstruir sequências de isoformas. A saída é Trinity.fasta contendo transcrições montadas. Avalie a qualidade da montagem com BUSCO em relação ao conjunto de dados de linhagem apropriado: busco -i Trinity.fasta -l eukaryota_odb10 -o busco_out -m transcriptome. Uma pontuação BUSCO completa acima de 80% indica uma montagem de alta qualidade. Métricas adicionais incluem contig N50 (calculado com TrinityStats.pl Trinity.fasta) e o número de transcrições montadas que correspondem a proteínas conhecidas via BLASTX contra UniProt. Reduza a redundância com CD-HIT-EST -c 0.95 -i Trinity.fasta -o Trinity_nr.fasta para agrupar isoformas com 95% de identidade. Para montagem guiada por referência com StringTie, primeiro alinhe as leituras com STAR: stringtie -p 8 -G annotation.gtf -o assembly.gtf alinhado.bam. StringTie monta transcrições usando um algoritmo de fluxo de rede e pode ser executado sem um GTF de referência para descoberta de novas transcrições. Mescle montagens entre amostras com stringtie --merge para criar um transcriptoma unificado. Quantifique a expressão com stringtie -e -B e use prepDE.py para gerar uma matriz de contagem para análise de expressão diferencial.
