A eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida separa misturas proteicas complexas por ponto isoelétrico na primeira dimensão e peso molecular na segunda dimensão, produzindo um mapa de alta resolução de centenas a milhares de pontos de proteína em um único gel.
Princípio
A 2D-PAGE combina dois princípios de separação ortogonais. Na primeira dimensão, as proteínas são separadas por focalização isoelétrica de acordo com sua carga líquida. Na segunda dimensão, elas são separadas por peso molecular via SDS-PAGE, idêntica a uma SDS-PAGE unidimensional padrão. O resultado é uma matriz bidimensional de pontos, cada um correspondendo a uma isoforma específica ou estado de modificação da proteína.
Primeira Dimensão — Focalização Isoelétrica
As amostras são solubilizadas em um tampão contendo ureia, tioureia, detergente CHAPS, DTT e anfólitos carreadores. Tiras de gradiente de pH imobilizado fornecem um gradiente de pH estável e reprodutível que varia de estreito (pH 4–7) a amplo (pH 3–10). A tira é reidratada com a amostra e então focalizada em voltagem crescente (300–8000 V) ao longo de várias horas a dezenas de quilovolt-horas. As proteínas migram para o pH onde sua carga líquida é zero — seu ponto isoelétrico. As tiras focalizadas são equilibradas em DTT (redução) seguido de iodoacetamida (alquilação) antes da segunda dimensão.
Segunda Dimensão — SDS-PAGE
A tira equilibrada é colocada sobre um gel de poliacrilamida e selada com agarose. As proteínas revestidas com SDS migram verticalmente através do gel, separando-se por peso molecular. Géis Laemmli padrão ou géis gradiente (ex., 8–16% de acrilamida) melhoram a resolução em toda a faixa de massa. Marcadores de peso molecular são carregados em uma extremidade. As proteínas são visualizadas por Azul Brilhante de Coomassie, coloração por prata, SYPRO Ruby ou marcação por fluorescência.
Preparação da Amostra
A qualidade da amostra é crítica para géis 2D reprodutíveis. Inibidores de protease e fosfatase são essenciais. As proteínas são precipitadas com TCA/acetona ou usando kits de limpeza para remover sais, lipídios e ácidos nucleicos que interferem na focalização. As amostras são quantificadas por ensaio de Bradford ou BCA. Para proteínas de membrana, detergentes adicionais ou solventes orgânicos melhoram a solubilização.
Detecção e Análise
Os géis são escaneados densitometricamente e analisados com software como PDQuest, Delta2D ou Melanie. A detecção de pontos, correspondência entre géis e normalização geram dados quantitativos de abundância. Pontos diferencialmente expressos são identificados por testes estatísticos. Pontos de interesse são excisados e identificados por espectrometria de massas após digestão tríptica no gel.
Vantagens e Limitações
A 2D-PAGE resolve proteínas intactas com modificações pós-traducionais, que deslocam os pontos horizontalmente (fosforilação, acetilação) ou verticalmente (glicosilação). Os limites de detecção são 1 ng por ponto com coloração por prata e 100 ng com Coomassie. As limitações incluem representação deficiente de proteínas muito ácidas ou básicas (pI < 3 ou > 10), proteínas de membrana (hidrofobicidade agrega durante a focalização), proteínas de peso molecular muito alto e muito baixo (> 200 kDa ou < 10 kDa) e proteínas de baixa abundância que ficam abaixo da detecção. A reprodutibilidade requer padronização cuidadosa em todas as etapas.
Aplicações
A 2D-PAGE é um pilar da proteômica para análise de expressão diferencial, comparando tecidos saudáveis e doentes, linhagens celulares tratadas e não tratadas, ou estágios de desenvolvimento. Ela mapeia isoformas de proteínas e modificações pós-traducionais, fornecendo um instantâneo do proteoma funcional. A eletroforese bidimensional diferencial em gel usa marcação com CyDye (Cy3, Cy5, Cy2) para processar duas ou três amostras no mesmo gel, eliminando a variabilidade gel a gel e melhorando a precisão quantitativa.
