A espectroscopia UV-Vis (Ultravioleta-Visível) é uma técnica analítica que mede a absorção de luz nas regiões ultravioleta (190-400 nm) e visível (400-800 nm) do espectro eletromagnético. É amplamente utilizado para análises quantitativas, estudos cinéticos e caracterização de transições eletrônicas em moléculas.

Princípio de absorção UV-Vis

Quando a luz passa através de uma amostra, as moléculas absorvem fótons cuja energia corresponde ao intervalo de energia entre os orbitais eletrônicos, promovendo os elétrons do estado fundamental para um estado excitado. A quantidade de luz absorvida em cada comprimento de onda é registrada como um espectro de absorção, e o comprimento de onda de absorção máxima (λmax) é característico de cada cromóforo. A Lei de Beer-Lambert (A = εcl) relaciona a absorbância (A) à absortividade molar (ε), ao comprimento do caminho (c) e à concentração (l), possibilitando a quantificação.

Instrumentação

Um espectrômetro UV-Vis compreende vários componentes. Uma lâmpada de deutério fornece luz para a faixa UV e uma lâmpada halógena de tungstênio para a faixa visível. Um monocromador (rede de difração ou prisma) seleciona uma faixa estreita de comprimentos de onda. O compartimento da amostra contém uma cubeta de quartzo para medições UV ou uma cubeta de vidro para medições na faixa visível, e um detector (tubo fotomultiplicador ou conjunto de fotodiodos) converte a luz transmitida em um sinal elétrico. Os instrumentos de feixe duplo dividem a luz em feixes de amostra e de referência para corrigir as flutuações do solvente e da lâmpada.

Aplicativos

A espectroscopia UV-Vis é usada para análise quantitativa de ácidos nucleicos (A260), proteínas (A280) e cinética enzimática, determinação de valores de pKa medindo alterações de absorbância com pH, controle de qualidade de produtos farmacêuticos, corantes alimentares e poluentes de água, e caracterização de complexos de metais de transição e compostos orgânicos conjugados.

Vantagens e Limitações

• Vantagens: Rápido, não destrutivo, requer pequenos volumes de amostra e é relativamente barato.
• Limitações: Mede apenas espécies cromóforas; as amostras devem ser transparentes e livres de partículas dispersas.

Protocolo Prático de Espectroscopia UV-Vis

Aqueça o instrumento por 15–30 minutos para estabilizar a lâmpada. Selecione cubetas de quartzo para medições UV (<350 nm), pois o vidro e o plástico absorvem a luz UV; use cubetas descartáveis de plástico ou vidro apenas para medições na faixa visível. Manuseie as cubetas pelas laterais foscas para evitar impressões digitais nas janelas ópticas. Encha uma cubeta de referência com a solução em branco (somente o solvente ou tampão) e a cubeta de amostra com a solução de analito. Insira a cubeta de referência no caminho do feixe de referência e a amostra no caminho do feixe de amostra. Para instrumentos de feixe único, colete primeiro um espectro de linha de base do branco e depois substitua pela amostra. Execute uma varredura de comprimento de onda de 200–800 nm em velocidade média (200 nm/min) para determinar λmax, o comprimento de onda de absorção máxima. Para análise quantitativa em comprimento de onda fixo, ajuste o instrumento para o λmax do analito. Meça a absorbância de uma série de soluções padrão (5–7 concentrações abrangendo a faixa esperada) e da amostra desconhecida. Construa uma curva de calibração traçando a absorvância versus concentração. Ajuste uma regressão linear, a lei de Beer-Lambert (A = εbc) afirma que a relação deve ser linear com uma interceptação próxima de zero, desde que a absorbância esteja entre 0,1 e 1,0 (a faixa linear da maioria dos instrumentos). Se a absorvância exceder 1,0, dilua a amostra. Para quantificação de DNA a 260 nm, use o coeficiente de extinção de 50 ng/μL por unidade OD para DNA de fita dupla e 33 ng/μL por unidade OD para DNA de fita simples. A pureza é avaliada pela razão A260/A280 (~1,8 para DNA puro, ~2,0 para RNA puro) e razão A260/A230 (>2,0). Para quantificação de proteínas a 280 nm, meça o A280 de uma proteína purificada e calcule a concentração usando o coeficiente de extinção molar da proteína. Para a cinética enzimática, monitore a mudança na absorvância ao longo do tempo em um comprimento de onda fixo, por exemplo, o consumo de NADH a 340 nm (ε = 6220 M⁻¹cm⁻¹) para medir a atividade da desidrogenase.

Aplicação no mundo real

Em um estudo da enzima álcool desidrogenase, a oxidação do etanol em acetaldeído é acoplada à redução do NAD⁺ a NADH, que é absorvido a 340 nm. A reação é monitorada a 340 nm durante 5 minutos a 30°C com etanol 0,1-10 mM. As velocidades iniciais são plotadas versus concentração de substrato e ajustadas à equação de Michaelis-Menten, produzindo Km = 1,2 mM e Vmax = 85 μM/min.