A cristalografia de raios X determina a estrutura atômica tridimensional de proteínas e outras macromoléculas medindo os ângulos e as intensidades dos raios X difratados por um cristal, calculando então mapas de densidade eletrônica a partir dos quais modelos atômicos são construídos.
Princípio
Quando os raios X atingem um cristal, eles são espalhados pelas nuvens eletrônicas dos átomos. A rede regularmente espaçada do cristal causa interferência construtiva — difração — em ângulos específicos descritos pela lei de Bragg. Medir as posições e intensidades dos pontos de difração permite a reconstrução da distribuição da densidade eletrônica. Este mapa de densidade é então interpretado ajustando-se um modelo atômico, que é refinado contra os dados observados.
Cristalização de Proteínas
A difração requer cristais com ordem tridimensional regular. A proteína é purificada a >95% de homogeneidade a 5–20 mg/mL. Telas de cristalização testam centenas de condições variando o precipitante (PEG, sulfato de amônio), pH, tampão, sal e aditivos. A difusão de vapor em gota sentada e gota pendente são os métodos padrão. Gotículas de proteína e solução do reservatório equilibram contra um reservatório maior, concentrando a proteína e promovendo a nucleação. Cristais adequados para difração crescem ao longo de dias a semanas e são coletados com criolaços.
Coleta de Dados
Os cristais são resfriados rapidamente em nitrogênio líquido a 100 K para reduzir danos por radiação. Os dados de difração são coletados em linhas de luz síncrotron, que fornecem feixes de raios X intensos e sintonizáveis. Um conjunto completo de dados compreende centenas a milhares de imagens de difração coletadas à medida que o cristal gira através de uma pequena faixa angular por imagem. O processamento de dados com XDS, iMosflm ou DIALS indexa as reflexões, integra as intensidades e dimensiona as medições. Os limites de resolução são definidos pelas reflexões de maior ângulo com intensidade mensurável; 2,0–3,0 Å é típico para estruturas de proteínas.
Problema de Fase
As intensidades medidas fornecem amplitudes, mas não fases, que são essenciais para a transformada de Fourier que reconstrói a densidade eletrônica. A substituição molecular resolve as fases colocando um modelo de estrutura homóloga na célula unitária cristalográfica e calculando sua difração prevista, o que fornece fases iniciais. Quando não existe um bom modelo de busca, a determinação experimental de fases usa derivados de átomos pesados (MIRAS) ou incorporação de selênio via selenometionina (MAD/SAD). Pipelines modernos automatizam a maior parte desse processo.
Construção e Refinamento do Modelo
O mapa de densidade eletrônica inicial é interpretado no Coot ou software similar, onde a cadeia polipeptídica é traçada e as cadeias laterais são posicionadas. O modelo passa por ciclos iterativos de ajuste manual e refinamento computacional com phenix.refine ou REFMAC5. O refinamento otimiza o modelo para minimizar a diferença entre os fatores de estrutura calculados e observados. A qualidade é monitorada por Rwork e Rfree. Uma estrutura confiável tipicamente tem Rfree abaixo de 0,25 a 2,5 Å de resolução.
Validação
O MolProbity valida a geometria do esqueleto, outliers de rotâmeros, pontuações de choque e estatísticas de Ramachandran. A correlação entre o modelo e a densidade eletrônica experimental é avaliada pelo fator R do espaço real. O relatório de validação do PDB, gerado para todos os depósitos, fornece um resumo de qualidade padronizado. Critérios recomendados: >90% Ramachandran favorecidos, <0,3% outliers de Ramachandran, <1% outliers de rotâmeros.
Aplicações
A cristalografia de raios X determinou a maioria das estruturas proteicas conhecidas no Banco de Dados de Proteínas. Ela elucidou mecanismos catalíticos de enzimas, interações fármaco-alvo incluindo inibidores de protease do HIV e quinases, e grandes complexos macromoleculares como o ribossomo. Juntamente com a espectroscopia NMR e a crio-EM, forma o conjunto central de ferramentas da biologia estrutural.
