A zimografia é uma técnica eletroforética que deteta a atividade enzimática de proteases, lipases, glicosidases e outras enzimas hidrolíticas. A aplicação mais comum é a deteção da atividade de metaloproteinases da matriz (MMP) em amostras biológicas.

Princípio

Uma amostra de proteína é separada por SDS-PAGE em condições não redutoras (sem DTT ou β-mercaptoetanol, estes destruiriam a atividade enzimática). O gel de separação é copolimerizado com um substrato, tipicamente gelatina (0,1% p/v) para deteção de MMP-2 e MMP-9, ou caseína para deteção de protease mais ampla. Após a eletroforese, o SDS é removido por lavagem numa solução de Triton X-100, permitindo que as proteases se renaturem. O gel é então incubado num tampão de desenvolvimento a 37 °C por 12–48 horas, durante o qual as proteases ativas digerem o substrato na sua vizinhança imediata. Após coloração com Azul de Coomassie, bandas claras aparecem contra um fundo azul escuro onde o substrato foi digerido.

Protocolo

1. Prepare o gel de separação com gelatina 0,1% ou caseína adicionada à solução de acrilamida (8–10% de acrilamida é padrão para MMPs). Inclua um gel de empilhamento sem substrato.
2. Carregue amostras sem ferver e sem agentes redutores. Use um tampão de amostra não redutor (Tris-HCl 62,5 mM pH 6,8, glicerol 25%, SDS 2%, azul de bromofenol 0,01%).
3. Corra a 100–150 V a 4 °C para evitar proteólise durante a eletroforese.
4. Lave o gel em tampão de renaturação (Triton X-100 a 2,5% em Tris-HCl 50 mM pH 7,5) por 2 × 30 minutos à temperatura ambiente com agitação suave.
5. Lave brevemente em tampão de desenvolvimento (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, CaCl₂ 10 mM, NaCl 150 mM, NaN₃ 0,02%, ZnCl₂ 1 µM).
6. Incube em tampão de desenvolvimento a 37 °C por 12–48 horas.
7. Cora com Azul de Coomassie R-250 (0,5% em metanol 30%, ácido acético 10%) por 1 hora.
8. Descor (metanol 30%, ácido acético 10%) até as bandas claras ficarem visíveis.
9. Imageie o gel e quantifique as bandas por densitometria.

Interpretação

As bandas aparecem como zonas claras num fundo azul. A sua posição indica o peso molecular (por comparação com padrões proteicos), e a sua intensidade é proporcional à quantidade de enzima ativa. O peso molecular da banda clara deve corresponder à forma pro ou ativa da protease esperada. Por exemplo, pro-MMP-9 aparece a ~92 kDa, MMP-9 ativa a ~82 kDa, pro-MMP-2 a ~72 kDa e MMP-2 ativa a ~62 kDa.

Zimografia Reversa

Para detetar inibidores de protease (TIMPs, inibidores teciduais de metaloproteinases), o gel é copolimerizado com substrato e uma protease padrão (ex.: meio condicionado de células HT-1080 contendo MMPs ativas). Após desenvolvimento e coloração, as bandas do inibidor aparecem como áreas escuras (coradas) onde o substrato não foi digerido, contra um fundo claro onde a protease adicionada digeriu o substrato em todo o resto.

Aplicações

A zimografia é usada para medir a atividade de MMP em extratos tumorais, fluido de feridas, fluido sinovial e sobrenadantes de cultura celular. É um ensaio padrão em biologia do cancro (as MMPs promovem invasão e metástase), doença cardiovascular (remodelação de placas) e remodelação tecidual. A zimografia quantitativa é possível com padrões de MMP purificados carregados no mesmo gel.

Limitações

A zimografia deteta a atividade proteolítica total naquele peso molecular, não necessariamente uma única enzima, múltiplas proteases podem co-migrar. Também não é verdadeiramente quantitativa num sentido absoluto (a cinética de digestão do substrato varia entre enzimas). Para medições de atividade específica, são preferidos ensaios de atividade baseados em ELISA ou ensaios de clivagem de substrato FRET.