Nach der Fixierung muss das Gewebe mit einem Trägermedium – typischerweise Paraffinwachs – infiltriert werden, um dünne Schnitte zu ermöglichen. Automatisierte Gewebeprozessoren befördern das Gewebe über einen Zeitraum von 8 bis 24 Stunden durch aufeinanderfolgende Reagenzienbäder und ersetzen in drei Phasen Wasser durch Paraffin: Dehydrierung, Reinigung und Infiltration.
Der Gewebeprozessor
Moderne Gewebeprozessoren sind geschlossene, belüftete Instrumente, die Körbe mit Gewebekassetten durch eine Reihe von Reagenzienstationen bewegen. Karussell-Prozessoren (Leica ASP300, Thermo Excelsior) drehen den Korb durch einzelne Reagenzbehälter. Tauch- und Rotationsprozessoren senken den Korb in eine einzelne Retorte ab, die nacheinander mit jedem Reagenz gefüllt und entleert wird. Beide Arten beinhalten einen Vakuum-/Druckzyklus während der Paraffininfiltration, der Wachs in Gewebehohlräume drückt und Restluft entfernt.
Prozessoren fassen 100–400 Kassetten pro Durchlauf. Ein typisches Protokoll über Nacht (14–16 Stunden) verarbeitet alle Routinebiopsien und kleinen Resektionen. Ein kürzeres (4–8 Stunden) „Schnell“-Protokoll wird für die Verarbeitung dringender Proben, Gefrierschnitt-Reste und kleiner Biopsien am selben Tag verwendet. Das Protokoll wird basierend auf Gewebetyp und -größe ausgewählt.
Dehydrierung
Wasser ist mit Paraffin nicht mischbar und muss vollständig entfernt werden. Bei der Dehydrierung werden abgestufte Ethanole (70 %, 80 %, 95 %, 100 %) in steigender Konzentration verwendet. Der Einsatz von 70 % Ethanol verhindert einen osmotischen Schock und übermäßiges Schrumpfen. Der Schritt mit 100 % Ethanol ist der kritischste – jegliches Restwasser verhindert das Eindringen von Paraffin und erzeugt spröde, schwer zu schneidende Blöcke. Absolutes Ethanol enthält <1 % Wasser; Es sollte häufig (alle 50–100 Läufe) gewechselt werden, um die Wirksamkeit aufrechtzuerhalten.
Dehydrierungsartefakte: unvollständige Dehydrierung (körnige, weiche Blöcke), übermäßige Dehydrierung (übermäßige Schrumpfung und Verhärtung kleiner Biopsien) und Übertragung von Wasser vom Ethanol zum Klärmittel (trübe Klärreagenzien).
Clearing
Klärmittel sind sowohl mit Ethanol als auch mit Paraffin mischbar. Sie ersetzen Ethanol im Gewebe und machen die Probe durchscheinend (daher „Clearing“ – das Gewebe erscheint klar, da der Brechungsindex dem Clearing-Mittel entspricht). Xylol ist das universelle Klärmittel – es hat eine gute Wirkung, muss aber als gefährliches Lösungsmittel (neurotoxisch, entflammbar) gehandhabt werden. Ersatzstoffe umfassen Isopropanol, Clearingmittel auf Limonenbasis (HistoClear, Citrisolv) und Dibutylphthalat. Xylol-Ersatzstoffe klären sich langsamer und können Rückstände des Klärmittels im Gewebe hinterlassen.
Reinigungsartefakte: unvollständige Ausräumung (undurchsichtige, weiße Flecken im Block – das Gewebe enthält noch Ethanol oder Wasser) und übermäßige Ausräumung (übermäßige Verhärtung, insbesondere von Fettgewebe).
Paraffin-Infiltration
Das Klärmittel wird nach und nach durch geschmolzenes Paraffinwachs (Schmelzpunkt 56–60 °C) ersetzt. Der Prozessor bewegt den Korb unter Vakuum durch zwei bis drei Paraffinbäder, alle 1–2 Stunden. Die Vakuuminfiltration (15–25 Zoll Hg) entfernt restliches Klärmittel und Luft aus Gewebehohlräumen und sorgt so für eine vollständige Penetration. Frisches Paraffin an der Endstation erzeugt die saubersten Blöcke.
Die Qualität des Paraffins beeinflusst das Schneiden. Zu den Paraffinzusätzen gehören DMSO (verbessert die Infiltration), Harze (verbessert das Schneiden von Hartgewebe) und Kunststoffpolymere (verbessert die Bandkontinuität). Das ideale Paraffin hat einen engen Schmelzbereich, eine gute Haftung am Gewebe und eine minimale Kristallbildung beim Abkühlen.
Protokollauswahl
Routineprotokoll (über Nacht, 14–16 Stunden) – geeignet für die meisten Biopsien und kleinen Resektionen (bis zu 4 mm Dicke). Reagenzzeiten: 70 % Ethanol (1 h), 80 % Ethanol (1 h), 95 % Ethanol (1 h × 2), 100 % Ethanol (1,5 h × 2), Xylol (1,5 h × 2), Paraffin (2 h × 2 mit Vakuum).
Protokoll für große Proben (24 Stunden) – für fetthaltige, dichte oder >4 mm-Proben. Längere Dehydratisierungsschritte (jeweils 2 Stunden), zusätzliche Xylolschritte (insgesamt 6–8 Stunden) und längere Paraffininfiltration (4 Stunden × 2). Fettgewebe erfordert eine längere Reinigung, da sich Fett in Xylol langsam auflöst.
Schnelles Protokoll (4–6 Stunden) – für kleine dringende Biopsien. Verwendet höhere Temperaturen (60 °C), kürzere Zeiten und stärkere Entwässerungsmittel (Isopropanol). Kann härtere Blöcke, aber angemessene Morphologie erzeugen.
Fehlerbehebung bei Verarbeitungsproblemen
Weiche oder matschige Blöcke – unvollständige Dehydrierung oder unzureichende Paraffininfiltration. Verarbeiten Sie das Gewebe erneut, indem Sie das Paraffin schmelzen und den Vorgang mit 100 % Ethanol wiederholen.
Spröde Blöcke – übermäßige Austrocknung, übermäßige Hitze oder längere Einwirkung von Xylol. Reduzieren Sie die Dörrzeiten oder senken Sie die Ofentemperatur. Geben Sie beim Schneiden einen Tropfen Netzmittel in das Wasserbad.
Gewebeschrumpfung – Bei normaler Verarbeitung kommt es zu einer linearen Schrumpfung von 10–15 %. Übermäßiges Schrumpfen resultiert aus einer zu frühen Anwendung hoher Ethanolkonzentrationen – stellen Sie eine abgestufte Dehydrierung ab 70 % sicher.
Weiße, kalkhaltige Bereiche im Block – unvollständige Reinigung (Restwasser oder Ethanol). Erneute Verarbeitung aus der Clearing-Phase.
Qualitätskontrolle
Überwachen Sie die Verarbeitungsqualität, indem Sie Blockaussehen (gleichmäßiges, durchscheinendes Paraffin ohne weiße Flecken), Schnittqualität (glatte Bänder ohne Rattern oder Reißen) und H&E-Qualität (klare Kerndetails ohne übermäßige Blässe) überprüfen. Die Reinheit der Reagenzien wird durch spezifisches Gewicht (Ethanol), Brechungsindex oder Testgewebeverarbeitungsläufe überprüft. Regelmäßige Wartung des Prozessors – Reinigung der Reagenzleitungen, Austausch von Dichtungen, Kalibrierung von Temperatur und Vakuum – verhindert Chargenfehler. Dokumentieren Sie alle Reagenzienänderungen und -wartungen im Qualitätssicherungsprotokoll.
