Die DNA-Methylierung an CpG-Dinukleotiden ist die am besten charakterisierte epigenetische Modifikation. Die Bisulfit-Umwandlung in Kombination mit der Sequenzierung liefert eine quantitative, genomweite Auslesung dieser Markierung.
Bisulfit-Chemie
Die Behandlung genomischer DNA mit Natriumbisulfit (NaHSO₃) bei niedrigem pH-Wert (pH 5,0, 50–70 °C, 4–16 Stunden) desaminiert unmethylierte Cytosine zu Uracil, während 5-Methylcytosin (5mC) und 5-Hydroxymethylcytosin (5hmC) resistent gegen Desaminierung sind. Nach der PCR-Amplifikation wird Uracil als Thymin und 5mC als Cytosin gelesen.
Die Umwandlungsrate sollte >99% betragen, um zuverlässig zu sein. Eine nicht-umgewandelte Lambda-Phagen-DNA-Spike-in wird oft verwendet, um die Umwandlungseffizienz zu messen.
Methoden
Genomweite Bisulfit-Sequenzierung (WGBS): Sequenzierung des gesamten Genoms nach Bisulfit-Umwandlung. Dies ist der Goldstandard für die umfassende Methylierungsanalyse mit Einzelbasenauflösung im gesamten Genom. Die Rechenkosten sind hoch: 30-fache Abdeckung erfordert ~900 Millionen Reads für das menschliche Genom. Da bisulfit-umgewandelte DNA weitgehend C→T (und G→A auf dem Komplementärstrang) ist, erfordert die Ausrichtung einen spezialisierten Drei-Buchstaben-Genomindex (C→T umgewandelt auf beiden Strängen).
Reduced Representation Bisulfite Sequencing (RRBS): Genomische DNA wird zunächst mit einem methylierungsunempfindlichen Restriktionsenzym (MspI, C↓CGG) verdaut, das an CpG-reichen Regionen schneidet. Fragmente werden größenfraktioniert (40–220 bp), bisulfit-umgewandelt und sequenziert. RRBS reichert CpG-Inseln, Promotoren und andere regulatorische Regionen zu ~10–20% der Kosten von WGBS an.
Gezielte Bisulfit-Sequenzierung: PCR-Primer werden so entwickelt, dass sie spezifische Regionen von Interesse aus bisulfit-umgewandelter DNA amplifizieren. Das PCR-Produkt wird mittels Sanger- oder NGS-Sequenzierung analysiert. Gezielte Multiplex-Panels, die Hunderte von Regionen abdecken, sind kommerziell erhältlich. Dieser Ansatz ist kosteneffektiv für Projekte, die auf bestimmte Gen-Panels fokussiert sind.
Pyrosequenzierung: Eine quantitative Echtzeit-Sequenzierungsmethode für kurze Amplikons (100–200 bp) aus bisulfit-umgewandelter DNA. Die Peakhöhe an jeder C-Position spiegelt das Verhältnis von C (methyliert) zu T (unmethyliert) wider und liefert einen quantitativen Methylierungsprozentsatz an jeder CpG-Stelle. Die Pyrosequenzierung ist der Goldstandard für die Validierung von durch Array oder NGS identifizierten Methylierungsmarken.
Datenanalyse
Die Methylierung an jeder CpG-Stelle wird als β-Wert angegeben: β = M / (M + U + 100), wobei M für methylierte und U für unmethylierte Reads steht. β-Werte reichen von 0 (vollständig unmethyliert) bis 1 (vollständig methyliert).
Die differentielle Methylierungsanalyse identifiziert differentiell methylierte Positionen (DMPs) und Regionen (DMRs) zwischen Bedingungen. Die meisten Methoden verwenden ein Beta-Binomial-Modell, um die variable Abdeckung über CpG-Stellen hinweg zu berücksichtigen.
Unterscheidung von 5mC und 5hmC
Die Standard-Bisulfit-Sequenzierung kann 5-Methylcytosin nicht von 5-Hydroxymethylcytosin unterscheiden, beide werden vor der Desaminierung geschützt. Zur spezifischen Detektion von 5hmC sind zusätzliche Methoden erforderlich:
- TAB-Seq: T4-β-Glucosyltransferase schützt 5hmC mit Glucose, dann oxidiert TET1 5mC zu 5caC, das dann durch Bisulfit in Uracil umgewandelt wird. Nur 5hmC wird als C gelesen.
- oxBS-Seq: Kaliumperruthenat (KRuO₄) oxidiert 5hmC zu 5fC, das durch Bisulfit in Uracil umgewandelt wird. 5mC bleibt als C erhalten. Der Vergleich von oxBS-Seq mit Standard-BS-Seq ergibt den 5hmC-Spiegel durch Subtraktion.
