Während CRISPR/Cas9 für die Bearbeitung einzelner Gene verwendet wird, skaliert das CRISPR-Screening die Genom-Editierung auf das gesamte Genom in einem einzigen Experiment und identifiziert Gene, die Resistenz, Sensitivität oder einen bestimmten Phänotyp vermitteln.

Prinzip

Ein gepoolter CRISPR-Screen verwendet eine Bibliothek von Single-Guide-RNA-Sequenzen (sgRNA), die auf jedes Gen im Genom (oder eine fokussierte Teilmenge) abzielen. Jede sgRNA lenkt Cas9 zu einer bestimmten genomischen Lokalität, um einen Doppelstrangbruch zu erzeugen, was zu einem Knockout führt. Durch die Verfolgung, welche sgRNAs in einer Population unter Selektion angereichert oder verarmt werden, identifiziert der Screen funktionell relevante Gene.

Bibliotheksdesign

Genomweite CRISPR-Bibliotheken (Brunello, TKOv3, GeCKO) enthalten 4–6 sgRNAs pro Gen plus 100–1000 Nichtziel-Kontrollen. Jede sgRNA ist eine 20 nt-Sequenz, die auf eine PAM-benachbarte Stelle im Genom abzielt. Die Bibliothek wird als Oligonukleotid-Pool synthetisiert, in einen lentiviralen Vektor kloniert und in Lentiviren verpackt.

Screen-Workflow

1. Transduktion: Infektion Cas9-exprimierender Zellen mit der lentiviralen sgRNA-Bibliothek bei niedriger Multiplizität der Infektion (MOI ~0,3), sodass die meisten Zellen eine einzelne sgRNA erhalten. Ausreichend Zellen verwenden, um eine ~500-fache Repräsentation jeder sgRNA zu gewährleisten.
2. Selektion: 48 Stunden nach der Transduktion Puromycin (oder ein anderes Selektionsantibiotikum) zugeben, um Zellen zu selektieren, die die Bibliothek integriert haben.
3. Phänotypische Selektion: Nach 7–14 Tagen Kultivierung die experimentelle Bedingung anwenden: Medikamentenbehandlung, Toxinexposition, Nahrungsmangel oder Sortieren von Zellen basierend auf einem Reporter (z. B. einem Signalweg-Reporter). Eine parallele Kontrollpopulation wird ohne Selektion kultiviert.
4. Sequenzierung: Extraktion der genomischen DNA aus beiden Populationen, PCR-Amplifikation der sgRNA-kodierenden Region und Sequenzierung auf einer Illumina-Plattform.
5. Analyse: Ausrichtung der Reads an der Bibliotheksreferenz, Zählen der sgRNAs pro Gen und Berechnung der Fold-Change zwischen selektierten und Kontrollpopulationen. Gene mit signifikant verarmten sgRNAs sind essentiell für das Überleben unter der Bedingung; angereicherte sgRNAs weisen auf Resistenzgene hin.

Wichtige Überlegungen

• Repräsentation: Mindestens 500 Zellen pro sgRNA während des gesamten Screens aufrechterhalten, um Dropout-Artefakte zu vermeiden.
• Cas9-Expression: Die Zellen müssen Cas9 in hohen Mengen exprimieren. Stabile Cas9-exprimierende Linien oder Cas9-Knock-in-Linien werden bevorzugt.
• Kontrollen: Eine Toxizitätskontrolle (z. B. eine hohe Dosis des Medikaments) einschließen, um zu bestätigen, dass die Verarmung spezifisch ist, und eine Kontrolle ohne Selektion, um Wachstumseffekte der sgRNAs selbst zu berücksichtigen.

Anwendungen

CRISPR-Screens wurden verwendet, um Resistenzmechanismen gegen Chemotherapeutika, zielgerichtete Therapien und Immuntherapien zu identifizieren; Wirtsfaktoren zu entdecken, die für virale Infektionen erforderlich sind; synthetisch letale Interaktionen in Krebszellen zu kartieren; und Gene zu identifizieren, die Zelldifferenzierung, Migration und Stoffwechsel regulieren.

Vergleich mit shRNA-Screens

CRISPR-Screens erzeugen vollständige Knockouts (Leserasterverschiebungen) anstelle von Knockdowns (mRNA-Abbau) und ermöglichen so einen konsistenteren und vollständigeren Funktionsverlust. Sie haben weniger Off-Target-Effekte als shRNA aufgrund der längeren Zielsequenz (20 nt vs. 19 nt) und der Anforderung einer PAM-Sequenz. Allerdings sind CRISPR-Screens auf protein-kodierende Gene beschränkt, während shRNA-Screens auch nicht-kodierende RNAs angreifen können.