Bei der DNA-Ligation und -Klonierung handelt es sich um eine Reihe von Techniken, mit denen DNA-Fragmente zusammengefügt und in einen Vektor – ein Träger-DNA-Molekül – eingefügt werden, um sie in einem Wirtsorganismus, typischerweise Bakterien, zu replizieren. Dadurch können Wissenschaftler große Mengen einer bestimmten DNA-Sequenz produzieren.
Wie DNA-Ligation und Klonen funktionieren
- Vorbereiten des Einsatzes und Vektors
Sowohl das interessierende DNA-Fragment (das Insert) als auch der Vektor (normalerweise ein Plasmid) werden mit denselben Restriktionsenzymen geschnitten. Dadurch entstehen komplementäre klebrige Enden – kurze, einzelsträngige Überhänge, die Basenpaare miteinander bilden können.
- Ligation
Das geschnittene Insert und der Vektor werden mit DNA-Ligase vermischt, einem Enzym, das das Zucker-Phosphat-Rückgrat der DNA versiegelt. Die komplementären klebrigen Enden richten sich aus und die Ligase bildet kovalente Bindungen, die das Insert dauerhaft mit dem Vektor verbinden.
- Transformation
Das ligierte Plasmid wird durch einen als Transformation bezeichneten Prozess in kompetente Bakterienzellen eingeführt. Dies wird häufig durch Hitzeschock oder Elektroporation erreicht, wodurch die Bakterienmembran vorübergehend für DNA durchlässig wird.
- Auswahl
Die transformierten Bakterien werden auf Agar mit einem Antibiotikum ausplattiert. Das Plasmid trägt ein Antibiotikaresistenzgen, sodass nur Bakterien überleben, die das Plasmid aufgenommen haben. Dadurch entstehen Kolonien, die jeweils von einer einzelnen Zelle abstammen, die die geklonte DNA enthält.
- Screening
Kolonien werden durch Kolonie-PCR oder Restriktionsverdau gescreent, um zu bestätigen, dass sie das richtige Insert enthalten. Positive Kolonien werden in Flüssigkultur gezüchtet, um große Mengen des gewünschten Plasmids zu produzieren.
Praktisches Ligationsprotokoll
Berechnen Sie das optimale molare Verhältnis von Einsatz zu Vektor mithilfe der Formel: Masse des Einsatzes (ng) = (Masse des Vektors (ng) × Einsatzgröße (kb) / Vektorgröße (kb)) × gewünschtes Verhältnis. Verwenden Sie für die Standardklonierung ein molares Verhältnis von Insert:Vektor von 3:1. Richten Sie eine 10-µL-Ligationsreaktion ein: 50 ng linearisierter Vektor, die berechnete Masse des Einsatzes, 1 µL 10× T4-DNA-Ligase-Puffer (enthält ATP), 1 µL T4-DNA-Ligase (400 U/µL) und Wasser auf 10 µL. Schließen Sie zwei Kontrollen ein: eine Nur-Vektor-Ligation (kein Einsatz), um den Hintergrund der Selbstligation zu messen, und eine Kontrolle ohne Ligase. Für maximale Effizienz 1–2 Stunden bei 16 °C oder über Nacht bei 4 °C inkubieren. Für Blunt-End-Ligationen 1 µL Ligase verwenden und 16 Stunden bei 16 °C inkubieren. Nach der Ligation 2–5 µL durch Hitzeschock in 50 µL kompetente E. coli-Zellen umwandeln: 30 Minuten auf Eis inkubieren, 45 Sekunden auf 42 °C erhitzen, 2 Minuten auf Eis zurückstellen, 950 µL SOC-Medium hinzufügen und 1 Stunde bei 37 °C unter Schütteln inkubieren. 100 µL auf LB-Agar mit dem entsprechenden Antibiotikum ausplattieren und bei Verwendung des Blau-Weiß-Screenings 40 µL X-Gal (20 mg/ml) und 40 µL IPTG (100 mM) hinzufügen. Weiße Kolonien zeigen eine erfolgreiche Insertion an (gestörtes lacZ-Gen), während blaue Kolonien einen selbstligierten Vektor enthalten. Eine gute Ligation sollte 10–100-mal mehr Kolonien ergeben als die Nur-Vektor-Kontrolle, mit >70 % weißen Kolonien.
Für Anwendungen, die eine schnellere oder flexiblere Assemblierung erfordern, bieten moderne Methoden wie Gateway-Klonierung, Gibson-Assemblierung und moderne Klonierungsmethoden leistungsstarke Alternativen zur traditionellen Restriktions-basierten Klonierung.
Reale Anwendung
Beim Klonieren eines 0,8 kb großen GFP-Gens in pUC19 (2,7 kb) mit einem molaren Verhältnis von 3:1 erzeugt die Ligation etwa 200 Kolonien auf Ampicillin-X-Gal-Platten. Davon sind 165 (82 %) weiß. Die Kolonie-PCR an 10 weißen Kolonien bestätigt das GFP-Insert in allen 10 und zeigt eine effiziente Ligation und ein effizientes Screening.
