Die genaue Quantifizierung von DNA und RNA ist eine Voraussetzung für reproduzierbare Molekularbiologie. Zwei Hauptansätze dominieren: Spektrophotometrie und Fluorometrie.

UV-Spektrophotometrie (NanoDrop)

Das NanoDrop-Spektrophotometer misst 1–2 µL Probe, die direkt auf einen Sockel aufgebracht wird, und nutzt die Oberflächenspannung zur Erzeugung einer definierten Schichtdicke (0,2–1,0 mm). Es misst die Absorption bei 230, 260 und 280 nm:

• A₂₆₀ misst die Nukleinsäurekonzentration. Für dsDNA gilt 1 OD₂₆₀ = 50 ng/µL; für RNA 1 OD₂₆₀ = 40 ng/µL; für ssDNA 1 OD₂₆₀ = 33 ng/µL.
• A₂₈₀ misst Protein- und Phenolkontamination. Eine reine DNA-Probe hat ein A₂₆₀/A₂₈₀-Verhältnis von ~1,8; reine RNA ~2,0.
• A₂₃₀ misst organische Verbindungen, chaotrope Salze und Phenol. Das A₂₆₀/A₂₃₀-Verhältnis sollte für reine Nukleinsäuren ~2,0–2,2 betragen.

Das NanoDrop ist schnell und benötigt minimale Probenmenge, kann aber nicht zwischen DNA und RNA unterscheiden und wird von Nukleotiden, einzelsträngigen Fragmenten und anderen UV-absorbierenden Verunreinigungen beeinflusst.

Fluorometrische Quantifizierung (Qubit)

Das Qubit-Fluorometer verwendet fluoreszierende Farbstoffe, die spezifisch an dsDNA, RNA oder Protein binden. Nach der Bindung fluoresziert der Farbstoff stark, und die Fluoreszenzintensität ist proportional zur Konzentration.

Qubit-Assays sind hochselektiv — der dsDNA-Assay erkennt keine ssDNA oder RNA, und der RNA-Assay erkennt keine DNA. Sie sind auch empfindlicher als die Spektrophotometrie und detektieren Konzentrationen von nur 0,1 ng/µL. Der Nachteil sind die Kosten pro Assay (Reagenzien auf Farbstoffbasis) und die Notwendigkeit von zwei Kalibrationsstandards pro Assay.

Auswahl einer Methode

Verwenden Sie Spektrophotometrie für die Routinequantifizierung von gereinigter Plasmid-DNA, PCR-Produkten ohne Proteinkontamination und zur Überprüfung der Reinheitsverhältnisse. Verwenden Sie Fluorometrie für wertvolle Proben (NGS-Bibliotheksvorbereitung, ChIP-DNA), wenn die Probe Nukleotide oder degradierte Fragmente enthält, oder wenn Sie dsDNA in Gegenwart von RNA spezifisch quantifizieren müssen.

Agarosegel-Quantifizierung

Für die semiquantitative Beurteilung führen Sie die Probe auf einem Agarosegel neben einem Marker mit bekannten Bandenintensitäten (z. B. 100 ng, 50 ng, 25 ng) auf. Die Fluoreszenzintensität von Ethidiumbromid oder SYBR Safe korreliert grob mit der Masse. Digitale Geldokumentationssysteme können die Bandenintensität für eine Schätzung integrieren, aber diese Methode ist weniger genau als Spektrophotometrie oder Fluorometrie.