Der Enzymimmunoassay (ELISA) ist ein plattenbasierter Immunoassay zum Nachweis und zur Quantifizierung spezifischer Proteine, Antikörper, Hormone und anderer Moleküle. Es kombiniert die Spezifität von Antikörpern mit der Empfindlichkeit des enzymbasierten Nachweises.
Wie ELISA funktioniert
- Beschichtung
Eine Mikrotiterplatte ist mit einem Antigen oder Fängerantikörper beschichtet. Das Zielmolekül bindet durch passive Adsorption an die Oberfläche. Die Platte wird über Nacht inkubiert und dann gewaschen, um ungebundenes Material zu entfernen.
- Blockieren
In die Vertiefungen wird eine Blockierungslösung gegeben, die ein irrelevantes Protein wie BSA oder Kasein enthält. Dadurch werden alle verbleibenden Bindungsstellen auf der Plattenoberfläche abgedeckt und eine unspezifische Bindung in nachfolgenden Schritten verhindert.
- Nachweisantikörper
Ein an ein Enzym konjugiertes Erkennungsantikörper – am häufigsten Meerrettichperoxidase (HRP) oder alkalische Phosphatase (AP) – wird hinzugefügt. Bei einem Sandwich-ELISA bindet ein Primärantikörper das Ziel und ein enzymgebundener Sekundärantikörper den Primärantikörper.
- Signalerzeugung
Ein Substrat für das Enzym wird hinzugefügt. Das Enzym wandelt das Substrat in ein farbiges, fluoreszierendes oder leuchtendes Produkt um. Man lässt die Reaktion eine bestimmte Zeit lang ablaufen und stoppt sie dann.
- Messung
Das Signal wird mit einem Plattenlesegerät gemessen. Die Intensität des Signals ist proportional zur Menge des Zielmoleküls in der Probe. Eine Standardkurve mit bekannten Konzentrationen ermöglicht die Quantifizierung.
- ELISA-Formate
- Direkter ELISA: Antigen wird beschichtet und ein enzymgebundener Antikörper weist es direkt nach.
- Indirekter ELISA: Antigen wird beschichtet, ein primärer Antikörper bindet und ein enzymgebundener sekundärer Antikörper erkennt es.
- Sandwich-ELISA: Ein Fängerantikörper wird beschichtet, das Antigen bindet und ein Detektionsantikörper vervollständigt das Sandwich.
- Kompetitiver ELISA: Das Signal nimmt mit steigender Zielkonzentration ab.
Praktisches Sandwich-ELISA-Protokoll
Beschichten Sie eine 96-Well-Mikrotiterplatte mit hoher Bindung mit 100 µL/Well Capture-Antikörper, verdünnt in Beschichtungspuffer (0,1 M Carbonat-Bicarbonat-Puffer pH 9,6) in einer Konzentration von 1–5 µg/ml. Über Nacht bei 4°C inkubieren. Waschen Sie die Platte dreimal mit 300 µL/Well PBST (PBS + 0,05 % Tween-20) mit einem Plattenwascher oder einer Mehrkanalpipette. Blockieren Sie jede Vertiefung mit 200 µL Blockierungspuffer (PBST mit 3 % BSA oder 5 % fettfreier Trockenmilch) für 1 Stunde bei Raumtemperatur. 3 Mal waschen. Fügen Sie 100 µL/Well Standards (Reihenverdünnungen des Zielproteins, typischerweise 7 Konzentrationen im Bereich von 1000 pg/ml bis 15 pg/ml) und Proben hinzu, jeweils in zweifacher Ausfertigung. 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. 5 Mal waschen. Fügen Sie 100 µL/Well des Nachweisantikörpers (biotinyliert oder direkt enzymkonjugiert) in der optimierten Konzentration hinzu (typischerweise 0,5–2 µg/ml). 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. 5 Mal waschen. Wenn Sie einen biotinylierten Nachweisantikörper verwenden, geben Sie 30 Minuten lang 100 µL Streptavidin-HRP (1:2000) pro Vertiefung hinzu und waschen Sie es fünfmal. 100 µL/Well TMB-Substratlösung hinzufügen und 15–30 Minuten im Dunkeln inkubieren. Stoppen Sie die Reaktion mit 50 µL/Well 2N H2SO4. Messen Sie die Absorption bei 450 nm mit einem Plattenlesegerät innerhalb von 30 Minuten. Erstellen Sie eine Standardkurve, indem Sie die Absorption gegen die logarithmische Konzentration auftragen und ein 4-Parameter-Logistikmodell (4PL) oder 5-Parameter-Logistikmodell anpassen. Berechnen Sie Probenkonzentrationen durch Interpolation aus der Standardkurve. Akzeptable Kurven haben einen R² > 0,98 und zurückgerechnete Standardkonzentrationen innerhalb von 70–130 % der erwarteten Werte.
Reale Anwendung
Ein Sandwich-ELISA für menschliches TNFα im Patientenserum verwendet einen monoklonalen Fängerantikörper und einen polyklonalen Nachweisantikörper. Der Assay hat einen Nachweisbereich von 15–1000 pg/ml mit einer Quantifizierungsgrenze von 20 pg/ml. Serum von Patienten mit rheumatoider Arthritis zeigt TNFα-Werte von 85 ± 32 pg/ml (n = 24) im Vergleich zu 12 ± 7 pg/ml bei gesunden Kontrollpersonen, was TNFα als Biomarker für Entzündungen bestätigt und Entscheidungen zur Anti-TNFα-Therapie unterstützt.
