Die Epigenomik untersucht genomweite Muster der DNA-Methylierung, Histonmodifikationen und Chromatinzugänglichkeit. Zwei der am weitesten verbreiteten epigenomischen Techniken sind ATAC-Seq und Bisulfit-Sequenzierung.
ATAC-Seq
ATAC-Seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin) kartiert Regionen offenen Chromatins — nukleosomendepletierte DNA, an die Transkriptionsfaktoren und andere regulatorische Proteine binden. Es verwendet die hyperaktive Tn5-Transposase, die DNA gleichzeitig fragmentiert und Sequenzieradapter in zugängliche Chromatinregionen einfügt.
Das Protokoll ist bemerkenswert einfach:
- Sammeln Sie 50.000 Zellen (frisch oder kryokonserviert).
- Lysieren Sie die Zellmembranen, um Kerne freizusetzen.
- Inkubieren Sie die Kerne mit Tn5-Transposase, die mit Sequenzieradaptern beladen ist, für 30 Minuten bei 37 °C.
- Reinigen Sie die tagmentierte DNA, amplifizieren Sie sie mittels PCR mit Barcode-Primern und sequenzieren Sie Paired-End auf einer Illumina-Plattform.
Die Reads werden gegen das Referenzgenom aligniert, und Peaks der Transposaseaktivität zeigen offenes Chromatin an. Diese Peaks sind an Promotoren, Enhancern und anderen regulatorischen Elementen angereichert. ATAC-Seq kann auch die Nukleosomenpositionierung und Transkriptionsfaktor-Bindungsfootprints aus dem Muster der Fragmentlängen ableiten.
Die Hauptvorteile sind die Geschwindigkeit (die gesamte Bibliotheksvorbereitung dauert 2–3 Stunden) und der geringe Probenbedarf (bis zu 500 Zellen, und Einzelzell-ATAC-Seq ist mittlerweile Routine).
Bisulfit-Sequenzierung
Die Bisulfit-Sequenzierung detektiert 5-Methylcytosin (5mC) in DNA. Die Behandlung mit Natriumbisulfit wandelt unmethylierte Cytosine in Uracil um (das nach PCR als Thymin gelesen wird), während methylierte Cytosine unverändert bleiben. Die resultierende Sequenz wird mit einem Referenzgenom verglichen, um den Methylierungsstatus mit Einzelbasenauflösung zu bestimmen.
Whole-Genome Bisulfite Sequencing (WGBS) liefert eine umfassende Methylierungskarte, ist aber teuer. Reduced Representation Bisulfite Sequencing (RRBS) verwendet MspI-Verdau zur Anreicherung CpG-reicher Regionen, was die Sequenzierungskosten senkt. Gezielte Bisulfit-Sequenzierung amplifiziert spezifische Regionen von Interesse, wie Promotor-CpG-Inseln.
Wichtige Überlegungen:
- Die Bisulfitbehandlung degradiert DNA. Beginnen Sie mit 100–500 ng hochwertiger DNA.
- Die Umwandlungseffizienz sollte >99 % betragen. Spike-in-unmethylierte Lambda-DNA-Kontrollen ermöglichen die Berechnung der Umwandlungsrate.
- Das Alignment erfordert einen Bisulfit-bewussten Aligner (Bismark, BSMAP oder BWA-meth), der Reads gegen ein Bisulfit-konvertiertes Referenzgenom kartiert.
- Die Methylierung wird als β-Werte (0 bis 1) oder M-Werte für jede CpG-Stelle angegeben.
Gemeinsamkeiten der Datenanalyse
Sowohl ATAC-Seq als auch Bisulfit-Sequenzierung produzieren FASTQ-Dateien, die gegen das Referenzgenom aligniert werden. Für ATAC-Seq erfolgt die Peak-Erkennung mit MACS2 oder Genrich; für Bisulfit-Daten erfolgt die Methylierungserkennung mit Skripten innerhalb der Bismark-Pipeline. Zu den Qualitätsmetriken gehören der Anteil der Reads in Peaks (FRiP) für ATAC-Seq und die Bisulfit-Umwandlungsrate für Methylierungsdaten.
