Die Fixierung ist der erste und wichtigste Schritt bei der Gewebeerhaltung. Es stoppt den Zellverfall, stabilisiert Makromoleküle und härtet das Gewebe für die anschließende Verarbeitung und Sektionierung. Die Qualität aller nachgelagerten Techniken – H&E-Färbung, IHC, molekulare Analyse – hängt von einer angemessenen und angemessenen Fixierung ab.

Ziele der Fixierung

Die Hauptziele der Fixierung bestehen darin, die Autolyse (Selbstverdauung durch intrazelluläre Enzyme) und die Fäulnis (bakterielle Zersetzung) zu verhindern; um die Gewebemorphologie so nah wie möglich am lebenden Zustand zu erhalten; um Gewebe zum verzerrungsfreien Schneiden zu härten; zur Stabilisierung zellulärer Bestandteile (Proteine, Nukleinsäuren, Kohlenhydrate) für die Färbung; und um Zellen für Farbstoffe und Antikörper durchlässig zu machen. Kein einzelnes Fixiermittel erreicht alle Ziele optimal – die Wahl hängt von der beabsichtigten nachgelagerten Anwendung ab.

Formalinchemie

10 % neutral gepuffertes Formalin (NBF) ist das universelle Fixiermittel in der Histopathologie. Kommerzielles Formalin ist eine 37 %ige wässrige Lösung von Formaldehydgas – 10 % NBF ist eine 1:10-Verdünnung (3,7 % Formaldehyd). Der neutrale Puffer (ein- und zweibasiges Natriumphosphat, pH 7,0–7,2) verhindert die Bildung von Ameisensäure (die saures Hämatinpigment verursacht) und sorgt für optimale Vernetzungsbedingungen.

Formaldehyd vernetzt Proteine, indem es Methylenbrücken (-CH2-) zwischen benachbarten Aminogruppen bildet, insbesondere der Epsilon-Aminogruppe von Lysin und den Amidgruppen von Peptiden. Dadurch entsteht ein dreidimensionales Gelnetzwerk, das die Gewebestruktur stabilisiert. Die Vernetzung ist temperaturabhängig – sie verläuft bei 37 °C etwa doppelt so schnell wie bei Raumtemperatur. Die routinemäßige Fixierung bei Raumtemperatur erfordert bei kleinen Biopsien 6–24 Stunden und bei größeren Proben 24–48 Stunden. Die Standardregel ist 1 Stunde pro mm Gewebedicke.

Faktoren, die die Fixierung beeinflussen

Das Fixiermittelvolumen muss mindestens das 10- bis 20-fache des Gewebevolumens betragen. Bei unzureichendem Volumen erschöpft sich das Fixiermittel, bevor die Penetration abgeschlossen ist. Gewebedicke – die Schnitte sollten für eine ausreichende Penetration nicht dicker als 4–5 mm sein; Dickere Abschnitte lassen sich in der Mitte schlecht befestigen. Temperatur – eine höhere Temperatur beschleunigt die Fixierung, erhöht aber die Autolyse, bevor das Fixiermittel eindringt; Die Raumtemperatur ist für den routinemäßigen Gebrauch optimal. Rühren – sanfte Rotation verbessert die Fixiermittelzirkulation um die Probe. Verzögerung bis zur Fixierung – die Zeit bei warmer Ischämie (Zeit von der Gefäßklemmung bis zur Probenentnahme) und die Zeit bei kalter Ischämie (Zeit von der Entfernung bis zur Fixierung) müssen minimiert werden. Eine längere Kälteischämie baut RNA, Proteine und Phosphoproteine ab (beeinflusst IHC, insbesondere ER und phosphospezifische Marker).

Arten von Fixiermitteln

Vernetzende (Aldehyd-)Fixierungsmittel – Formaldehyd, Glutaraldehyd (für EM), Glyoxal (eine weniger toxische Alternative). Glutaraldehyd bietet eine hervorragende Erhaltung der Ultrastruktur, dringt jedoch langsam ein und verursacht eine stärkere Vernetzung, wodurch Antigene für IHC maskiert werden können.

Koagulative Fixiermittel – Ethanol, Methanol, Aceton. Diese präzipitieren Proteine, indem sie die Hydratationshüllen aufbrechen, statt sie zu vernetzen. Sie bewahren die Enzymaktivität und die Nukleinsäuren, verursachen jedoch eine stärkere Schrumpfung und eine schnellere Verhärtung des Gewebes. Die Alkoholfixierung wird für PCR und molekulare Tests verwendet.

Kombinierte Fixiermittel – Bouins Lösung (Pikrinsäure, Formaldehyd, Essigsäure) liefert hervorragende Kerndetails und wird für endokrine Gewebe, Hodenbiopsien und Magen-Darm-Biopsien verwendet. B5-Fixiermittel (Quecksilberchlorid, Formaldehyd) wurde früher für Lymphknoten verwendet, wird heute jedoch aufgrund der Quecksilbertoxizität nur noch selten verwendet. Zinkformalin ist eine quecksilberfreie Alternative zur Konservierung von Lymphantigenen.

Nicht vernetzende Alternativen – molekulare Fixiermittel (PAXgene, HOPE) konservieren Nukleinsäuren und Proteine für die molekulare Analyse, bieten jedoch eine weniger optimale Morphologie als Formalin. Sie werden hauptsächlich im Biobanking und in der Forschung eingesetzt.

Verarbeitung nach der Fixierung

Nach der Fixierung werden die Proben zur Lagerung in 70 %iges Ethanol überführt, falls sich die Verarbeitung verzögert. Gewebe können ohne Nebenwirkungen wochenlang in 70 %igem Ethanol aufbewahrt werden. Eine längere Lagerung in Formalin (>72 Stunden) führt zu einer Überfixierung, die die Antigenmaskierung und DNA-Fragmentierung erhöht. Zur Langzeitkonservierung kann formalinfixiertes Gewebe nach 24–48 Stunden in Ethanol überführt werden.

Qualitätskontrolle

Die Fixierung wird anhand der Frische des Fixiermittels (die Lösungen werden regelmäßig gewechselt), der Fixierungszeit (auf der Anforderung dokumentiert), des Aussehens (gut fixiertes Gewebe ist fest und gleichmäßig blass) und der Qualität der nachgeschalteten Färbung (schlechte Fixierung äußert sich in schlechter Detailgenauigkeit des Kerns, Blässe oder Kanteneffekten bei H&E) überwacht. Qualitätssicherungsprogramme umfassen eine regelmäßige Überprüfung der Indikatoren für die Angemessenheit der Fixierung.