Die Fluoreszenzmikroskopie erkennt die Emission von Licht von Fluorophoren bei Wellenlängen, die länger als die Anregungswellenlänge sind. Es ermöglicht die hochspezifische Visualisierung mehrerer molekularer Ziele gleichzeitig im selben Gewebeabschnitt. Die konfokale Mikroskopie erweitert die Fluoreszenzbildgebung, indem sie unscharfes Licht unterdrückt und so scharfe optische Schnitte durch dicke Proben erzeugt.
Prinzipien der Fluoreszenz
Ein Fluorophor absorbiert Photonen einer bestimmten Anregungswellenlänge und hebt Elektronen in einen höheren Energiezustand. Wenn das Elektron in seinen Grundzustand zurückkehrt, emittiert es ein Photon mit einer längeren (energieärmeren) Wellenlänge – dieser Unterschied ist die Stokes-Verschiebung. Ein Fluoreszenzmikroskop verwendet eine Lichtquelle (Quecksilberbogen, Xenon, LED oder Laser), einen Anregungsfilter, der nur die Anregungswellenlänge durchlässt, einen dichroitischen Spiegel, der Anregungslicht reflektiert und Emissionslicht durchlässt, und einen Emissionsfilter, der nur die Emissionswellenlänge zum Detektor durchlässt.
Fluorophore, die häufig in der Gewebeanalyse verwendet werden, umfassen DAPI (DNA, blau), FITC (grün), TRITC (rot) und Alexa Fluor-Farbstoffe (verbesserte Helligkeit und Photostabilität). Quantenpunkte sind Halbleiter-Nanokristalle mit größenabstimmbaren Emissionsspektren, die Multiplexing mit einer einzigen Anregungsquelle ermöglichen.
Immunfluoreszenz im Gewebe
Direkte Immunfluoreszenz verwendet einen primären Antikörper, der direkt an ein Fluorophor konjugiert ist. Indirekte Immunfluoreszenz verwendet einen unmarkierten Primärantikörper, der von einem Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörper nachgewiesen wird – die Signalverstärkung von mehreren Sekundärantikörpern pro Primärantikörper erhöht die Empfindlichkeit.
Immunfluoreszenz in formalinfixiertem, in Paraffin eingebettetem Gewebe erfordert eine Antigengewinnung, die mit der chromogenen IHC identisch ist. Gefrorene Schnitte erzeugen häufig eine stärkere Fluoreszenz, da die Antigene durch die Fixierung nicht vernetzt werden. Autofluoreszenz von Lipofuscin, Elastin und roten Blutkörperchen kann stören – der Einsatz von spektraler Entmischung oder Schmalbandfiltern minimiert dies.
Multiplex-Immunfluoreszenz (mIF) verwendet aufeinanderfolgende Färbezyklen, Tyramid-Signalverstärkung (TSA) oder Spektralbildgebung, um 6–12 Marker auf einem einzelnen Abschnitt zu erkennen. Dies ermöglicht eine detaillierte Charakterisierung der Tumor-Mikroumgebung, einschließlich Untergruppen von Immunzellen, Expression von Checkpoint-Molekülen und räumlichen Beziehungen.
Konfokale Mikroskopie
Bei der konfokalen Mikroskopie wird im Emissionspfad eine Lochblende verwendet, die unscharfes Licht blockiert. Nur Licht aus der Brennebene erreicht den Detektor und erzeugt einen optischen Abschnitt mit einer Dicke von etwa 0,5–1,0 µm. Durch Scannen des Lasers über die Probe und Sammeln aufeinanderfolgender optischer Schnitte (Z-Stapel) ist eine dreidimensionale Rekonstruktion von Gewebestrukturen möglich.
Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (LSCM) verwendet einen fokussierten Laserstrahl, der Punkt für Punkt über die Probe rastet. Es bietet höchste Auflösung und Flexibilität für die Mehrkanalbildgebung. Die konfokale Spinnscheibenmikroskopie verwendet eine rotierende Scheibe mit Tausenden von Nadellöchern, wodurch Bilder schneller und mit weniger Photobleichung aufgenommen werden – ideal für die Bildgebung lebender Zellen.
Multiphotonenmikroskopie
Bei der Multiphotonen-(Zwei-Photonen-)Mikroskopie wird Infrarot-Laserlicht verwendet, bei dem sich zwei Photonen niedrigerer Energie vereinen, um ein Fluorophor anzuregen. Dies ermöglicht eine tiefere Gewebepenetration (bis zu 1 mm), eine verringerte Phototoxizität und intrinsische optische Schnitte ohne Lochblende. Es wird für die intravitale Bildgebung von Gewebestruktur und Zellverhalten in lebenden Tieren verwendet.
Anwendungen in der Histopathologie
Immunfluoreszenz ist die Standardnachweismethode in der Nierenpathologie (IgA-Nephropathie, Lupusnephritis), der Dermatopathologie (bullöse Erkrankungen) und der Neuropathologie (Alzheimer-Krankheit: Amyloid-Beta- und Tau-Kolokalisation). Konfokale Mikroskopie ermöglicht eine detaillierte Analyse der Gewebearchitektur in drei Dimensionen. Multiplex IF wird zunehmend in der Immuntherapieforschung eingesetzt, um die Immunzellverteilung und PD-L1-Expressionsmuster für die [prädiktive Biomarker-Entwicklung] abzubilden (/guides/predictive-and-prognostic-ihc-markers.html).
Einschränkungen
Fluorophore bleichen bei längerer Anregung photochemisch aus (verlieren dauerhaft ihre Fluoreszenz) – verwenden Sie lichtbeständige Eindeckmedien und minimieren Sie die Lichteinwirkung. Autofluoreszenz ist ein besonderes Problem bei formalinfixiertem Gewebe, das Lipofuszin enthält (häufig bei alternden Geweben, Herz- und Lebergewebe) – spektrale Entmischung oder Photobleichung vor der Behandlung können hilfreich sein. Konfokale Bildgebung ist langsamer als Weitfeld-Bildgebung und erfordert spezielle Ausrüstung und Schulung.
