Nach der PCR-Amplifikation oder dem Restriktionsverdau muss die DNA von Enzymen, Primern, Nukleotiden, Salzen und Pufferkomponenten gereinigt werden, bevor sie für nachgeschaltete Anwendungen verwendet wird. Zwei verwandte Methoden decken die meisten Reinigungsbedürfnisse ab.

PCR-Reinigung

Die PCR-Reinigung entfernt Primer, dNTPs, Polymerasen und Salze aus einer Amplifikationsreaktion. Die meisten kommerziellen Kits verwenden eine Silicamembran in einer Säule: Die DNA bindet in Gegenwart einer hohen Konzentration chaotroper Salze an die Membran, Verunreinigungen fließen durch, und die DNA wird in einem salzarmen Puffer (typischerweise 10 mM Tris oder Wasser) eluiert.

Das typische Protokoll: Bindungspuffer (mit Guanidinhydrochlorid oder einem ähnlichen Chaotrop) direkt zur PCR-Reaktion geben, auf die Säule laden, zentrifugieren, mit ethanolhaltigem Waschpuffer waschen, erneut zentrifugieren und in 20–50 µL eluieren. Die Ausbeute beträgt typischerweise 60–90 %.

Die PCR-Reinigung ist schnell (5–10 Minuten) und funktioniert für Fragmente >100 bp. Sie entfernt keine Primer-Dimere oder unspezifischen Produkte ähnlicher Größe — nur überschüssige Primer und kleine Fragmente, die durch die Säule passen.

Gelextraktion

Die Gelextraktion isoliert eine spezifische DNA-Bande aus einem Agarosegel und entfernt alle anderen DNA-Fragmente, einschließlich Primer-Dimeren und falsch primed Produkten. Die gewünschte Bande wird unter UV-Licht mit einem sauberen Skalpell ausgeschnitten, und die Agarose wird in einer chaotropen Salzlösung bei 50–60 °C gelöst. Die geschmolzene Agarose wird dann wie bei der PCR-Reinigung durch eine Silicasäule gegeben.

Wichtige Überlegungen:

• Minimieren Sie die UV-Expositionszeit, um DNA-Schäden zu vermeiden (verwenden Sie 365 nm UV anstelle von 302 nm, wenn verfügbar).
• Schneiden Sie so nah wie möglich an der Bande, um das Agarosevolumen zu minimieren.
• Der Lösungsschritt erfordert genügend Puffer — typischerweise 3 Volumen pro Gelenheitsvolumen.
• Die Ausbeute nimmt für Fragmente >10 kb ab; das Inkubieren des gelösten Gels bei Raumtemperatur anstatt auf der Säule verbessert die Rückgewinnung großer Fragmente.

DNA-Reinigung durch Fällung

Die Ethanolpräzipitation ist eine traditionelle Alternative, die keine Kits erfordert. Fügen Sie 0,1 Volumen 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 2,5 Volumen kaltes 100% Ethanol hinzu, inkubieren Sie bei −20 °C oder −80 °C, zentrifugieren Sie bei maximaler Geschwindigkeit für 15–30 Minuten, waschen Sie mit 70% Ethanol, lufttrocknen Sie und resuspendieren Sie. Diese Methode funktioniert für jede Fragmentgröße, dauert aber länger und entfernt dNTPs nicht so effizient wie Silicasäulen.

Qualitätskontrolle

Messen Sie nach der Reinigung das A₂₆₀/A₂₈₀-Verhältnis, um die Reinheit zu überprüfen (idealerweise 1,8–2,0). Führen Sie einen Aliquot auf einem Gel auf, um zu überprüfen, ob die Bande intakt und die richtige Größe hat. Für die Klonierung sollte der Elutionspuffer mit nachgeschalteten Enzymen kompatibel sein — eluieren Sie in Wasser oder 10 mM Tris (nicht EDTA, wenn eine Ligation folgt).