Der GST-Tag-Pull-Down verwendet an Glutathion-Agarose immobilisierte Glutathion-S-Transferase (GST)-Fusionsproteine, um rekombinante Proteine aus Expressionssystemen zu reinigen oder Protein-Protein-Interaktionen aus Zelllysaten zu erfassen und zu identifizieren.
Prinzip
Das 26 kDa große GST-Protein aus Schistosoma japonicum wird an das Zielprotein fusioniert. GST bindet an auf Agarosekügelchen immobilisiertes Glutathion (GSH, γ-Glutamyl-Cysteinyl-Glycin) mit hoher Affinität (K_d ≈ 0,1 µM). Das Fusionsprotein wird aus Rohlysaten erfasst, ausgiebig gewaschen und mit 10–20 mM reduziertem Glutathion unter nicht-denaturierenden Bedingungen eluiert. Für Interaktionsstudien dient das immobilisierte GST-Fusionsprotein als Köder, um interagierende Proteine aus einem Lysat zu erfassen, die dann durch Western Blot oder Massenspektrometrie identifiziert werden.
Glutathion-Harze
Glutathion-Agarose besteht typischerweise aus quervernetzten Agarosekügelchen mit über das Schwefelatom gekoppeltem Glutathion. Die Bindungskapazität beträgt 5–15 mg GST-Fusionsprotein pro mL Harz. Reduziertes Glutathion wird als kompetitives Elutionsmittel verwendet. Vor der Verwendung ist ein Quellen und Äquilibrieren in PBS oder ähnlichem Puffer (pH 7,3–8,0) erforderlich. Glutathion-Magnetkügelchen ermöglichen schnelle Pull-Downs in Mikrozentrifugenröhrchen für kleinere Interaktionsstudien.
Expression und Lyse
GST-Fusionsproteine werden in E. coli BL21(DE3)-Stämmen aus pGEX-Vektoren (GE Healthcare) exprimiert, die einen mit IPTG induzierbaren tac-Promotor enthalten. Expression bei 18–25 °C über Nacht verbessert die Löslichkeit schwieriger Zielproteine. Lyse in PBS (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄, pH 7,3) mit 1 % Triton X-100 oder 0,1 % Tween-20 reduziert unspezifische Bindung. DTT (1–5 mM) hält GST in seiner aktiven reduzierten Form. Proteaseinhibitoren und DNase/RNase verbessern die Lysatqualität.
Reinigungsprotokoll
Glutathion-Agarose mit PBS äquilibrieren. Geklärtes Lysat mit Harz inkubieren (Batch: 30–60 min, 4 °C; Säule: Schwerkraftfluss). Mit 20 Volumina PBS plus 0,1 % Triton X-100 waschen. Mit 10 mM reduziertem Glutathion in 50 mM Tris-HCl pH 8,0 eluieren. 0,5 mL-Fraktionen sammeln. Eluiertes Protein dialysieren, um Glutathion für nachgelagerte Anwendungen zu entfernen. Den GST-Tag durch Thrombin- oder PreScission-Protease-Spaltung an einer konstruierten Erkennungsstelle entfernen, gefolgt von einem subtraktiven Glutathion-Agarose-Schritt, um freies GST und ungespaltenes Fusionsprotein zu erfassen.
Pull-Down-Protokoll für Interaktionen
50–200 µg GST-Fusionsköder auf 25–50 µL Glutathion-Agarose immobilisieren. Mit Zelllysat (0,5–2 mg Gesamtprotein) in Bindungspuffer (PBS + 0,1 % NP-40) für 1–2 Stunden bei 4 °C unter Rotation inkubieren. 3–5 Mal mit Bindungspuffer waschen. Mit 2× SDS-Probenpuffer eluieren und durch SDS-PAGE mit anschließender Coomassie-Färbung oder Western Blot analysieren. Nur-GST-Kügelchen als Negativkontrolle einschließen, um Proteine zu identifizieren, die unspezifisch an GST oder das Harz binden. Kompetitives Glutathion (10 mM) vor der Inkubation zeigt spezifische Kompetition.
Vorteile und Grenzen
Der GST-Tag verbessert oft die Expression und Löslichkeit seines Fusionspartners, was ihn wertvoll für schwierige Proteine macht. Die Glutathion-Elution ist mild und erhält die Proteinaktivität. Die große Größe (26 kDa) kann jedoch einige funktionelle Assays beeinträchtigen, was eine Tag-Entfernung erforderlich macht. Die Dimerisierung von GST kann eine unerwünschte Oligomerisierung von Fusionsproteinen verursachen. Der Tag ist ideal für Affinitätserfassungs-Interaktionsstudien, aber weniger geeignet, wenn die Addition von 26 kDa für Strukturarbeiten problematisch ist.
