Isothermale Amplifikationsmethoden amplifizieren Nukleinsäuren bei konstanter Temperatur und eliminieren die Notwendigkeit eines Thermocyclers. Sie werden zunehmend in der Point-of-Care-Diagnostik, Feldtests und ressourcenlimitierten Umgebungen eingesetzt.

LAMP-Übersicht

Die Loop-vermittelte isothermale Amplifikation (LAMP) verwendet 4–6 Primer, die 6–8 verschiedene Regionen auf der Zielsequenz erkennen. Die Reaktion wird bei 60–65 °C unter Verwendung einer DNA-Polymerase mit Strangverdrängungsaktivität (Bst-Polymerase aus Bacillus stearothermophilus) durchgeführt. Die Polymerase verdrängt kontinuierlich neu synthetisierte Stränge und erzeugt Schleifenstrukturen, die als Matrizen für weitere Amplifikation dienen.

Das Ergebnis ist eine exponentielle Amplifikation, die bis zu 10⁹ Kopien in weniger als einer Stunde produziert. Aufgrund des komplexen Primersatzes und der verzweigten Amplifikationsprodukte ist LAMP extrem spezifisch — es kann Einzelnukleotidunterschiede unterscheiden.

LAMP-Primerdesign

Ein LAMP-Primerset umfasst:

• FIP (Forward Inner Primer): enthält F2- und F1c-Sequenzen
• BIP (Backward Inner Primer): enthält B2- und B1c-Sequenzen
• F3 und B3 (äußere Primer): initiieren die Strangverdrängung
• Optionale Loop-Primer (LF und LB): beschleunigen die Reaktion durch Priming der Schleifenstrukturen

Das Primerdesign ist entscheidend und wird typischerweise mit spezieller Software (PrimerExplorer, LAMP Designer) durchgeführt. Die Zielregion sollte 200–300 bp betragen.

Nachweismethoden

LAMP-Produkte können nachgewiesen werden durch:

• Trübung: die große Menge Magnesiumpyrophosphat-Niederschlag, der während der Amplifikation entsteht, ist mit bloßem Auge sichtbar.
• Kolorimetrische Farbstoffe: Phenolrot oder Hydroxynaphtholblau wechseln die Farbe, wenn sich der pH-Wert der Reaktion ändert oder Magnesium verbraucht wird.
• Fluoreszenz: interkalierende Farbstoffe (SYBR Green, EvaGreen) oder Calcein erzeugen ein fluoreszierendes Signal.
• Lateral Flow: unter Verwendung markierter Primer, die Haptene für den immunochromatographischen Streifennachweis einbauen.

Andere isothermale Methoden

• RPA (Recombinase Polymerase Amplification): verwendet eine Rekombinase, um Primer mit homologer Duplex-DNA zu paaren, ein einzelsträngiges DNA-Bindungsprotein zur Stabilisierung des verdrängten Strangs und eine strangverdrängende Polymerase. Sie arbeitet bei 37–42 °C und produziert innerhalb von 5–20 Minuten nachweisbares Produkt. RPA ist die schnellste isothermale Methode und mit gefriergetrockneten Formaten kompatibel.
• HDA (Helicase-Dependent Amplification): verwendet eine DNA-Helikase, um die Doppelhelix anstelle von Hitzedenaturierung zu entwinden, und arbeitet bei 37–65 °C, abhängig von der Helikase.
• NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification): amplifiziert RNA-Ziele bei 41 °C unter Verwendung von drei Enzymen (Reverse Transkriptase, RNase H und T7-RNA-Polymerase) und produziert RNA-Amplifikate.

Anwendungen

Isothermale Amplifikation wird häufig für den Erregernachweis (SARS-CoV-2, Malaria, Tuberkulose, Zika-Virus), Lebensmittelsicherheitstests und Umweltüberwachung eingesetzt. Die Fähigkeit, Reaktionen in einem Wasserbad oder Heizblock durchzuführen und Ergebnisse durch Farbänderung zu detektieren, macht sie ideal für dezentrale Tests.