Next-Generation-Sequencing (NGS) umfasst eine Reihe moderner Sequenzierungstechnologien, die Millionen von DNA-Fragmenten parallel sequenzieren können und es so ermöglichen, ganze Genome schnell und kostengünstig zu sequenzieren. Plattformen wie Illumina, Ion Torrent und PacBio dominieren das Feld.
So funktioniert NGS (Illumina-Plattform)
- Vorbereitung der Bibliothek
Die DNA ist in kleine Stücke fragmentiert, typischerweise 200–600 Basenpaare. Adapter – kurze bekannte Sequenzen – werden an beide Enden jedes Fragments ligiert. Diese Adapter ermöglichen die Bindung der Fragmente an die Durchflusszelle und dienen als Priming-Sites für die Sequenzierung.
- Cluster-Generierung
Die Bibliothek wird auf eine Durchflusszelle geladen, deren Oberfläche mit komplementären Oligonukleotiden beschichtet ist. Jedes Fragment bindet an die Durchflusszelle und durchläuft eine Brückenverstärkung: Das Fragment biegt sich um, ein neuer Strang wird synthetisiert und der Vorgang wiederholt sich, wodurch ein Cluster aus Tausenden identischer Kopien jedes Fragments entsteht.
- Sequenzierung durch Synthese
Fluoreszierend markierte Nukleotide werden einzeln über die Durchflusszelle geleitet. Jedes Nukleotid verfügt über einen reversiblen Terminator, der das Hinzufügen nur einer Base pro Zyklus ermöglicht. Nach jedem Zyklus wird die Fluoreszenz abgebildet, um zu identifizieren, welche Base zu jedem Cluster hinzugefügt wurde.
- Datenanalyse
Es werden Millionen von Sequenzierungslesungen generiert. Diese Lesevorgänge werden an einem Referenzgenom ausgerichtet oder de novo zusammengesetzt. Bioinformatik-Tools identifizieren je nach Anwendung genetische Varianten, Genexpressionsniveaus oder epigenetische Modifikationen.
- Bewerbungen
NGS wird neben vielen anderen Anwendungen für die Sequenzierung des gesamten Genoms, gezielte Gen-Panels, RNA-Sequenzierung, epigenetische Analyse und Metagenomik verwendet.
Praktischer Workflow zur NGS-Bibliotheksvorbereitung
Beginnen Sie mit 10–100 ng hochwertiger genomischer DNA (A260/A280 > 1,8, A260/A230 > 2,0). Fragmentieren Sie die DNA mit einem Covaris-Ultraschallgerät oder enzymatischer Fragmentierung, um eine Zielgröße von 200–600 bp zu erreichen. Führen Sie eine Endreparatur durch, um stumpfe Enden zu erzeugen, gefolgt von A-Tailing (Hinzufügen eines einzelnen Adenosins an die 3’-Enden) mithilfe des Klenow-Fragments. Ligieren Sie Illumina-kompatible Adapter, die einen 5’-T-Überhang enthalten, mit T4-DNA-Ligase zu den A-tailed-Fragmenten. Reinigen Sie die Ligationsprodukte mit AMPure XP-Kügelchen in einem Verhältnis von Kügelchen zu Probe von 0,8×, um nicht ligierte Adapter zu entfernen. Verstärken Sie die Adapter-ligierte Bibliothek durch PCR für 8–12 Zyklen unter Verwendung von Primern, die zu den Adaptersequenzen komplementär sind; enthalten einzigartige Dual-Index-Barcodes für das Multiplexen von Proben. Reinigen Sie das PCR-Produkt mit AMPure XP-Perlen im Verhältnis 0,8x. Bewerten Sie die Qualität und Quantität der Bibliothek mithilfe eines Bioanalyzers oder einer TapeStation (erwartete Größenverteilung: 250–700 bp) und der fluorometrischen Qubit-Quantifizierung. Normalisieren Sie die Bibliotheken auf 4 nM, bündeln Sie sie äquimolar und denaturieren Sie sie mit 0,2 N NaOH, bevor Sie sie für die 2 × 150 bp Paired-End-Sequenzierung mit 1,8 pM auf die Illumina-Durchflusszelle laden. Überwachen Sie die Clusterdichte (Ziel: 800–1.200 K/mm² für HiSeq 4000) und Q30-Scores (>80 % für Läufe mit hoher Qualität). Demultiplexen Sie die Ausgabe mit bcl2fastq und bewerten Sie die Qualität pro Basis mit FastQC. Trimmen Sie Adapter und minderwertige Basen vor dem Ausrichten mit Trimmomatic.
Reale Anwendung
Bei der klinischen Krebsgenomik wird ein gezieltes NGS-Panel mit 500 krebsbezogenen Genen verwendet, um ein Profil der Tumorbiopsie eines Patienten zu erstellen. Bei der Bibliotheksvorbereitung aus 50 ng FFPE-DNA werden 94 % der Ziele in einer Tiefe von >100x abgedeckt. Die Analyse identifiziert eine KRAS-G12C-Mutation (0,46 VAF) und eine EGFR-Amplifikation und leitet die Behandlungsauswahl mit einem MEK-Inhibitor.
