Die virale Titration ist essenziell für die Quantifizierung infektiöser Viren in der Forschung, Impfstoffproduktion und klinischen Diagnostik. Der Plaque-Assay ist der Goldstandard zur Messung des infektiösen Virustiters.

Das Plaque-Assay-Prinzip

Wenn ein Virus einen Monolayer empfänglicher Zellen in einer Kulturschale infiziert, repliziert es sich und breitet sich auf benachbarte Zellen aus. Nach mehreren Infektionsrunden wird eine lokalisierte Zone des Zelltods (eine Plaque) sichtbar. Es wird angenommen, dass jede Plaque von einem einzelnen infektiösen Viruspartikel ausgeht.

Der Ablauf:

1. Züchten Sie einen konfluenten Monolayer empfänglicher Zellen (z. B. Vero-Zellen für viele Viren) in einer Multivell-Platte.
2. Infizieren Sie den Monolayer mit seriellen Verdünnungen der Virusprobe.
3. Ermöglichen Sie die Virusadsorption für 1–2 Stunden unter periodischem Schwenken.
4. Überschichten Sie die Zellen mit einem halbfesten Medium (Agarose, Methylcellulose oder Carboxymethylcellulose), das die Ausbreitung des Virus über das flüssige Medium verhindert und die Infektion auf Zellen in der Nähe der ursprünglichen Infektionsstelle beschränkt.
5. Inkubieren Sie für 2–10 Tage (abhängig vom Virus), bis Plaques sichtbar sind.
6. Fixieren und färben Sie den Monolayer mit Kristallviolett, Neutralrot oder Formalin. Plaques erscheinen als klare Bereiche vor einem gefärbten Zellhintergrund.

Zählen Sie Plaques und berechnen Sie: plaquebildende Einheiten pro mL (PBE/mL) = (Anzahl der Plaques) / (Verdünnung × ausplattiertes Volumen in mL).

TCID₅₀-Assay

Der TCID₅₀ (50 % Tissue Culture Infectious Dose)-Assay ist eine Endpunktverdünnungsmethode, die keine Plaque-Visualisierung erfordert. Serielle Verdünnungen des Virus werden zu Replikat-Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit empfänglichen Zellen gegeben. Nach der Inkubation werden die Vertiefungen auf zytopathischen Effekt (CPE) bewertet. Der TCID₅₀ ist die Verdünnung, bei der 50 % der Vertiefungen CPE zeigen, berechnet nach der Reed-Muench- oder Spearman-Kärber-Methode.

TCID₅₀/mL-Werte können in PBE/mL umgerechnet werden (ungefähr 1 PBE ≈ 0,7 TCID₅₀-Einheiten), aber die Beziehung ist nicht exakt und hängt vom Virus und Zelltyp ab.

Fluoreszenzfokus-Assay

Für Viren, die keine klaren Plaques oder CPE produzieren, werden virale Proteine durch Immunfluoreszenz nachgewiesen. Der infizierte Monolayer wird fixiert und mit fluoreszierenden Antikörpern gegen ein virales Antigen gefärbt. Fluoreszierende Foci werden unter einem Epifluoreszenzmikroskop gezählt, was Fokus-bildende Einheiten pro mL (FFU/mL) ergibt.

Hämagglutinationstest

Einige Viren (Influenza, Paramyxoviren) haben Hämagglutininproteine, die rote Blutkörperchen binden und agglutinieren. Serielle Verdünnungen des Virus werden mit Erythrozyten in einer V-Boden-Platte gemischt. Der Hämagglutinationstiter ist die höchste Verdünnung, die noch eine Agglutination verursacht (ein diffuses Gitter von Erythrozyten, das sich nicht zu einem Knopf absetzt). Der HA-Test ist schnell und kostengünstig, misst aber gesamte Viruspartikel, nicht infektiöse.