Übersicht
Die Proteinidentifizierung mittels Massenspektrometrie ist der Grundstein der Proteomik. Der grundlegende Arbeitsablauf besteht darin, Proteine mithilfe einer Protease wie Trypsin in Peptide zu verdauen, die Massen der intakten Peptide zu messen (MS1) und dann ausgewählte Peptide zu fragmentieren, um Tandem-Massenspektren (MS/MS) zu erzeugen, die ihre Aminosäuresequenz offenbaren. Die resultierenden Spektren werden mit theoretischen Spektren abgeglichen, die aus Proteinsequenzdatenbanken abgeleitet wurden, um Identitäten zuzuordnen. Dieser Bottom-up- oder Shotgun-Ansatz ist hoch skalierbar und kann in einem einzigen Experiment Tausende von Proteinen aus komplexen Mischungen identifizieren.
Methoden
Peptide Mass Fingerprinting (PMF) identifiziert Proteine, indem die Liste der experimentell gemessenen Peptidmassen mit den theoretischen Peptidmassen verglichen wird, die aus einer Datenbank berechnet wurden. PMF funktioniert am besten für einfache Proteinmischungen oder gereinigte Proteine, die durch Techniken wie SDS-PAGE getrennt werden. Tandem-MS (MS/MS)-Identifizierung fragmentiert einzelne Peptide, um sequenzinformative Spektren zu erzeugen. Suchmaschinen vergleichen die beobachteten Fragmentionenreihen – hauptsächlich B- und Y-Ionen – mit vorhergesagten Reihen von Kandidatenpeptiden. De-novo-Sequenzierung leitet die Peptidsequenz direkt aus dem Spektrum ab, wenn keine Datenbankübereinstimmung gefunden wird, und nutzt die Massenunterschiede zwischen aufeinanderfolgenden Fragmentionen, um die Sequenz abzuleiten.
Praktisches Protokoll
Ein typischer Workflow zur Proteinidentifizierung beginnt mit einer Proteinmischung – beispielsweise einem immunpräzipitierten Komplex, einer SDS-PAGE-Gelbande oder einer Kapillargelelektrophorese-Fraktion. Proteine werden mit 10 mM Dithiothreitol (DTT) bei 56 °C für 30 Minuten reduziert, mit 55 mM Iodacetamid im Dunkeln für 30 Minuten alkyliert und über Nacht mit Trypsin bei einem Enzym-zu-Substrat-Verhältnis von 1:50 bei 37 °C verdaut. Die resultierenden Peptide werden mit C18 ZipTips entsalzt und auf ein nanoLC-System geladen, das an ein Orbitrap-Massenspektrometer gekoppelt ist. Das Instrument arbeitet im datenabhängigen Erfassungsmodus: Ein vollständiger MS1-Scan von 350–1.600 m/z bei einer Auflösung von 70.000 identifiziert die 15 intensivsten Vorläuferionen, die nacheinander durch energiereichere Kollisionsdissoziation (HCD) bei 27 % normalisierter Kollisionsenergie isoliert und fragmentiert werden, um MS/MS-Spektren zu erzeugen. Fragmentspektren werden mithilfe von Mascot oder SEQUEST anhand einer Proteindatenbank durchsucht. Jede Peptid-Spektrum-Übereinstimmung wird basierend auf der Korrelation zwischen experimentellen Fragmentionen und theoretischen b- und y-Ionenreihen bewertet. Eine Ziel-Köder-Suche schätzt den FDR und Übereinstimmungen werden mit 1 % FDR sowohl auf Peptid- als auch auf Proteinebene gefiltert. Die Proteingruppierung kollabiert Peptide, die je nach Sparsamkeit mehreren Proteinen zugeordnet werden können. Ein Beispiel für eine praktische Anwendung: Die Identifizierung der Zusammensetzung des menschlichen Kernporenkomplexes mittels biochemischer Fraktionierung und Massenspektrometrie ergab über 30 Nukleoporine, von denen viele bisher nicht charakterisiert waren, und lieferte ein umfassendes molekulares Bild des Kerntransports. Eine weitere Anwendung ist die Bakterienidentifizierung mittels MALDI-TOF-MS in der klinischen Mikrobiologie, wo ribosomale Proteinprofile als taxonomische Fingerabdrücke für die Identifizierung auf Artenebene innerhalb von Minuten statt Tagen dienen.
Anwendungen
Die Proteinidentifizierung wird in der gesamten Molekularbiologie und klinischen Forschung eingesetzt. Es bestätigt die Identität gereinigter Proteine, die durch Proteinextraktion und -reinigung erhalten wurden, charakterisiert Komponenten von Proteomik- und Massenspektrometrie-Experimenten und identifiziert Proteinkomplexe, die gemeinsam mit einem Köderprotein gereinigt wurden. In der Mikrobiologie wird es zur Identifizierung von Bakterienarten durch Massenspektrometrie-basierte Proteotypisierung verwendet und ergänzt genomische Ansätze.
