Proteine sind große, komplexe Moleküle, die in lebenden Organismen eine Vielzahl von Funktionen erfüllen. Ihre Funktion ist eng mit ihrer Struktur verbunden, die in vier verschiedene Ebenen unterteilt ist: primär, sekundär, tertiär und quartär.
Die vier Ebenen der Proteinstruktur
Primärstruktur
Die Primärstruktur ist die lineare Abfolge von Aminosäuren in einer Polypeptidkette. Jedes Protein hat eine einzigartige Sequenz, die durch das entsprechende Gen bestimmt wird. Sogar eine einzelne Aminosäureveränderung kann die Funktion des Proteins verändern, wie man es bei der Sichelzellenanämie sieht, wo ein einzelnes Valin eine Glutaminsäure ersetzt.
Sekundärstruktur
Die Sekundärstruktur bezieht sich auf lokale gefaltete Strukturen, die sich innerhalb der Polypeptidkette aufgrund von Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Grundgerüstatomen bilden. Die beiden häufigsten Typen sind die Alpha-Helix, eine rechtsdrehende Spirale, die durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen jeder vierten Aminosäure stabilisiert wird, und das Beta-Faltblatt, eine flache, plissierte Struktur, die durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen benachbarten, parallel oder antiparallel verlaufenden Polypeptidsegmenten gebildet wird.
Tertiärstruktur
Die Tertiärstruktur ist die dreidimensionale Gesamtform einer einzelnen Polypeptidkette. Es wird durch verschiedene Arten von Wechselwirkungen zwischen Seitenketten stabilisiert: hydrophobe Wechselwirkungen (unpolare Seitenketten gruppieren sich im Inneren des Proteins), Wasserstoffbrückenbindungen zwischen polaren Seitenketten, ionische Bindungen zwischen entgegengesetzt geladenen Seitenketten und Disulfidbrücken (kovalente Bindungen zwischen Cysteinresten).
Quartärstruktur
Die Quartärstruktur beschreibt, wie sich mehrere Polypeptidketten zu einem funktionellen Proteinkomplex zusammenfügen. Hämoglobin besteht beispielsweise aus vier Polypeptid-Untereinheiten – zwei Alpha- und zwei Beta-Ketten –, die beim Transport von Sauerstoff zusammenarbeiten.
Proteine falten sich spontan oder mit Hilfe molekularer Chaperone in ihre natürliche dreidimensionale Struktur. Fehlgefaltete Proteine können Aggregate bilden und werden mit Krankheiten wie Alzheimer und Parkinson in Verbindung gebracht.
Praktische Bestimmung und Visualisierung der Proteinstruktur
Drei experimentelle Hauptmethoden bestimmen Proteinstrukturen mit atomarer Auflösung. Röntgenkristallographie erfordert hochreines Protein (>95 %), konzentriert auf 5–20 mg/ml. Screenen Sie die Kristallisationsbedingungen mithilfe von Kits mit dünner Matrix (z. B. Hampton Research) mit 96-Well-Dampfdiffusionsversuchen mit sitzendem Tropfen. Optimieren Sie Treffer durch Variation von pH-Wert, Fällmittelkonzentration und Temperatur. Montieren Sie einen Kristall mit Beugungsqualität (0,1–0,5 mm) in einer Kryoschleife, kühlen Sie ihn bei 100 K in flüssigem Stickstoff ab und sammeln Sie Beugungsdaten an einer Synchrotron-Beamline. Verarbeiten Sie Daten mit XDS oder iMosflm, lösen Sie das Phasenproblem durch molekularen Ersatz (Phaser) unter Verwendung einer homologen Struktur, erstellen Sie das Modell in Coot und verfeinern Sie es mit phenix.refine. Zielauflösung: <3,0 Å; Eine gute Struktur hat Rwork/Rfree < 0,20/0,25. Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) funktioniert für kleine Proteine (<30 kDa) bei einer Konzentration von 0,5–1 mM in 10 % D2O. Zeichnen Sie 2D-¹⁵N-HSQC-, 3D-Triple-Resonanz-Spektren (HNCA, HNCO, CBCA(CO)NH) und NOESY für Abstandsbeschränkungen auf. Weisen Sie Rückgratresonanzen manuell oder mithilfe automatisierter Software zu (z. B. CARA, NMRFAM-SPARKY). Berechnen Sie Strukturen aus NOE-abgeleiteten Abstandsbeschränkungen und Diederwinkeln mit CYANA oder Xplor-NIH. Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) ist die Methode der Wahl für große Komplexe (>150 kDa). Tragen Sie 3 µL der Probe (0,1–1 mg/ml) auf ein glimmentladenes, löchriges Kohlenstoffgitter auf, tupfen Sie es 3–4 Sekunden lang ab und frieren Sie es in flüssigem Ethan ein. Sammeln Sie Filme auf einem Titan Krios bei 300 kV mit einem K2- oder K3-Detektor. Verarbeiten Sie mit RELION oder CryoSPARC durch Bewegungskorrektur, CTF-Schätzung, Partikelauswahl (2D-Klassifizierung), Ab-initio-Rekonstruktion, 3D-Klassifizierung und hochauflösende Verfeinerung. Verwenden Sie zur Strukturvisualisierung PyMOL oder ChimeraX, um PDB-Dateien zu laden. Zeigen Sie das Protein als Cartoons (Färbung der Sekundärstruktur), Oberflächen (elektrostatisches Potenzial) oder Stäbchen (Reste des aktiven Zentrums) an. Messen Sie Abstände, Winkel und Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Atomen.
Reale Anwendung
Das SARS-CoV-2-Spike-Protein (150 kDa Ektodomäne) wurde innerhalb von Monaten nach Ausbruch der Pandemie durch Kryo-EM mit einer Auflösung von 3,3 Å gelöst. Die Struktur zeigte die Rezeptorbindungsdomäne (RBD) in ihrer „oben“-Konformation, gebunden an ACE2, was ein strukturbasiertes Impfstoffdesign ermöglichte. Die PyMOL-Visualisierung der RBD-ACE2-Schnittstelle identifizierte wichtige Kontaktreste (K417, N501, Y453) und steuerte die Entwicklung neutralisierender Antikörper.
