RNA-Interferenz (RNAi) ist ein natürlicher Mechanismus, bei dem kleine RNA-Moleküle die Genexpression durch gezielte komplementäre mRNA für den Abbau oder die translationale Repression stilllegen. Es ist eines der leistungsfähigsten Werkzeuge für die funktionelle Genomik.
Mechanismus
Der RNAi-Weg beginnt mit doppelsträngiger RNA (dsRNA), die durch das Enzym Dicer in 21–23 Nukleotid lange small interfering RNAs (siRNAs) geschnitten wird. Diese siRNAs werden in den RNA-induced Silencing Complex (RISC) geladen, wo der Leitstrang zurückgehalten und der Passagierstrang verworfen wird. Der Leitstrang paart sich mit komplementärer mRNA, und Argonaute-2 (Ago2), die katalytische Komponente von RISC, spaltet die mRNA, wodurch die Translation verhindert wird.
Endogene microRNAs (miRNAs) folgen einem ähnlichen Weg, stammen aber von Haarnadelvorläufern ab (pri-miRNA → pre-miRNA → reife miRNA). Die meisten miRNAs binden mit unvollständiger Komplementarität an die 3′-UTR von Ziel-mRNAs und verursachen eher translationale Repression als Spaltung.
Experimentelle RNAi-Werkzeuge
- Synthetische siRNA: 21 bp dsRNA-Duplexe mit 2 nt Überhängen. Direkt in Zellen transfiziert. Wirksam für 3–7 Tage. Der häufigste Ansatz für transienten Knockdown.
- shRNA (short hairpin RNA): wird von einem Plasmid oder viralen Vektor exprimiert. Die Haarnadel wird durch Dicer zu siRNA verarbeitet. shRNA kann stabil mittels lentiviraler Vektoren integriert werden, was langfristigen Knockdown und die Erzeugung stabiler Zelllinien ermöglicht.
- miRNA-Mimetika und -Inhibitoren: synthetische RNAs, die endogene miRNAs nachahmen (Mimetika) oder sie blockieren (Antagomire, LNA-Sonden). Verwendet zur Untersuchung spezifischer miRNA-Funktionen.
Designüberlegungen
Effektives siRNA-Design erfordert:
- Zielgerichtete kodierende Region oder 3′-UTR des Gens
- Vermeidung von Off-Target-Treffern (Überprüfung mit BLAST)
- GC-Gehalt zwischen 35–55 %
- Vermeidung interner Wiederholungen und Sekundärstruktur
Mehrere siRNAs pro Ziel werden empfohlen. Fügen Sie eine nicht zielgerichtete (Scrambled) siRNA-Kontrolle hinzu, um spezifische von unspezifischen Effekten zu unterscheiden. Eine Positivkontrolle (z. B. siRNA gegen ein Housekeeping-Gen) bestätigt, dass die Transfektion und die RNAi-Maschinerie funktionieren.
Einschränkungen
- Off-Target-Effekte: siRNAs können unbeabsichtigte Gene durch partielle Komplementarität stilllegen, insbesondere in der Seed-Region (Positionen 2–8).
- Interferonantwort: lange dsRNA (>30 bp) löst eine angeborene Immunantwort aus. Verwenden Sie gereinigte synthetische siRNAs, um dies zu vermeiden.
- Haltbarkeit: siRNA wird durch Zellteilung verdünnt. Für Langzeitexperimente verwenden Sie shRNA oder mehrere Transfektionen.
- Unvollständiger Knockdown: Restprotein kann noch funktionell sein. Bestätigen Sie den Knockdown sowohl auf mRNA- (qPCR) als auch auf Proteinebene (Western Blot).
