Übersicht
Die RNA-Sequenzierung (RNA-seq) ist zur Standardmethode zur Messung der Genexpression geworden und ersetzt frühere hybridisierungsbasierte Ansätze. Durch die Umwandlung von RNA-Molekülen in eine cDNA-Bibliothek und die Sequenzierung von Millionen von Fragmenten stellt RNA-seq sowohl die Identität als auch die Häufigkeit von Transkripten in einer biologischen Probe sicher. Im Gegensatz zu Microarrays kann RNA-seq neuartige Transkripte, Spleißvarianten und nichtkodierende RNAs ohne vorheriges Sondendesign erkennen. Die Technik liefert einen Dynamikbereich über mehrere Größenordnungen und eine Einzelbasisauflösung. RNA-seq-Daten bilden die Grundlage für die meisten modernen Transkriptomstudien, von Modellorganismen bis hin zu klinischen Proben.
Schlüsselkonzepte
Die RNA-seq-Analysepipeline beginnt mit Rohsequenzierungsablesungen, die einer Qualitätskontrolle (FastQC), einem Adapter-Trimmen (Trimmomatic oder Cutadapt) und einer Ausrichtung auf ein Referenzgenom unter Verwendung von Spleiß-fähigen Alignern wie STAR oder HISAT2 unterzogen werden. Die Quantifizierung auf Gen- oder Transkriptebene wird durch Tools wie featureCounts, RSEM oder Salmon durchgeführt. Ausdruckswerte werden als FPKM, RPKM oder TPM normalisiert, um Sequenzierungstiefe und Transkriptlänge zu berücksichtigen. Die Erkennung von alternativem Splicing und neuartigen Transkripten erfordert spezielle Tools wie Cufflinks oder StringTie, die Transkripte aus ausgerichteten Lesevorgängen zusammensetzen. Zu den Qualitätsmetriken gehören Kartierungsraten, Leseverteilung über Genmerkmale und Sättigungsanalyse.
Anwendungen
RNA-seq wird in nahezu allen Bereichen der Biologie eingesetzt. Es profiliert Veränderungen der Genexpression bei Krankheiten im Vergleich zu gesundem Gewebe, identifiziert Biomarker für Krebssubtypen und verfolgt Genexpressionsprogramme in der Entwicklung. In der Mikrobiologie zeigt RNA-seq transkriptionelle Reaktionen auf Antibiotika und Umweltstress. Die Technik baut direkt auf den Methoden der RNA-Sequenzierung auf und wird häufig in Arbeitsabläufe zur Nächsten-Generation-Sequenzierung integriert. RNA-seq ermöglicht auch die Entdeckung neuer RNA-Strukturen und -Typen, einschließlich langer nichtkodierender RNAs und zirkulärer RNAs, und erweitert so unser Verständnis der Komplexität des Transkriptoms.
Praktisches Protokoll
Eine Standard-Massen-RNA-Seq-Pipeline beginnt mit rohen FASTQ-Dateien aus dem Sequenzer. Führen Sie zunächst „FastQC“ aus, um Qualitätsmetriken zu bewerten, einschließlich Qualitätsbewertungen pro Base, GC-Gehalt, Adapterkontamination und überrepräsentierten Sequenzen. Trimmen Sie minderwertige Basen und Restadapter mit „Trimmomatic“ oder „Cutadapt“: Ein typischer Befehl ist „trimmomatic PE sample_R1.fastq sample_R2.fastq -baseout trimmed.fq ILLUMINACLIP:adapters.fa:2:30:10 LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:36“. Für die spleißfähige Ausrichtung benötigt „STAR“ einen Genomindex, der mit „STAR –runMode genomeGenerate –genomeFastaFiles genome.fa –sjdbGTFfile annotation.gtf“ erstellt wurde. Richten Sie Lesevorgänge mit „STAR –runThreadN 8 –genomeDir star_index –readFilesIn trimmed_R1.fastq trimmed_R2.fastq –outSAMtype BAM SortedByCoordinate“ aus. Die Quantifizierung auf Genebene verwendet „featureCounts -a annotation.gtf -o counts.txt -t exon -g gene_idaligned.bam“ und erzeugt eine Zählmatrix, in der Zeilen Gene und Spalten Proben sind. Für die Quantifizierung auf Transkriptebene bietet „Salmon“ eine ausrichtungsfreie Schätzung: „salmon quant -i salmon_index -l A -1 R1.fastq -2 R2.fastq -o quant_output“. Zu den zu meldenden Qualitätskontrollmetriken gehören der eindeutig zugeordnete Leseprozentsatz (idealerweise > 80 %), die Zuordnungsrate zu exonischen Regionen, der 3’-Bias und der rRNA-Kontaminationsgrad. Bewerten Sie die Komplexität der Bibliothek mit „preseq“, um abzuschätzen, ob eine tiefere Sequenzierung zusätzliche erkannte Gene ergeben würde. Die endgültige Zählmatrix wird zur Differentialausdrucksanalyse mit DESeq2 oder EdgeR in R geladen. Für eine ausrichtungsfreie Quantifizierung umgeht der Quasi-Mapping-Ansatz von Salmon den Ausrichtungsschritt vollständig und ermöglicht so eine schnellere Verarbeitung bei gleichzeitiger Beibehaltung der Genauigkeit: „salmon quant -i transcript_index -l A -1 reads_R1.fastq -2 reads_R2.fastq –validateMappings -o quant“. Das Flag „–validateMappings“ verbessert die Empfindlichkeit für neuartige Transkripte.
