Übersicht
Die Sequenzierung kleiner RNA zielt auf die Klasse der kurzen, nicht-kodierenden RNA-Moleküle – typischerweise 18–35 Nukleotide lang – ab, die eine entscheidende regulatorische Rolle bei der Genexpression spielen. Dazu gehören microRNAs (miRNAs), small interfering RNAs (siRNAs) und Piwi-interacting RNAs (piRNAs). Trotz ihrer geringen Größe üben diese Moleküle eine starke Kontrolle über die mRNA-Stabilität, die Translation, den Chromatinzustand und die Transposon-Stummschaltung aus. Kleine RNA-Sequenzen erfordern eine spezielle Bibliotheksvorbereitung, um solche kurzen Fragmente zu erfassen, sowie spezielle Bioinformatik-Tools für eine genaue Annotation und Quantifizierung.
Methoden
Die Vorbereitung einer kleinen RNA-Seq-Bibliothek umfasst die Größenauswahl der RNA (typischerweise durch Gel-Exzision oder Bead-basierte Reinigung), die Ligation von 3’- und 5’-Adaptern, die reverse Transkription und die PCR-Amplifikation. Da kleine RNAs kürzer als die Leselänge sind, werden sie vollständig sequenziert und Adaptersequenzen müssen während der Vorverarbeitung präzise zugeschnitten werden. Dedizierte Alignment-Tools (wie miRDeep2, sRNAbench oder ShortStack) ordnen Lesevorgänge bekannten kleinen RNA-Datenbanken zu (miRBase für miRNAs, Rfam für andere ncRNAs). Die Quantifizierung schätzt die Expressionsniveaus bekannter miRNAs, während der Nachweis neuer miRNAs auf charakteristischen Haarnadel-Vorläuferstrukturen beruht. Die differenzielle Expressionsanalyse folgt ähnlichen Prinzipien wie mRNA-seq, jedoch mit besonderen Überlegungen zur Normalisierung, da kleine RNAs unterschiedliche Längenverteilungen und GC-Verzerrungen aufweisen.
Anwendungen
Die Analyse kleiner RNA-Profile hat die allgegenwärtige regulatorische Rolle dieser Moleküle aufgedeckt. miRNA-Signaturen unterscheiden Krebssubtypen und sagen das Ansprechen auf die Behandlung voraus. Zirkulierende miRNAs im Blut oder Serum dienen als minimalinvasive Biomarker für Krankheiten wie Krebs, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Neurodegeneration. Die Analyse stellt eine Verbindung zu umfassenderen Studien zu RNA-Struktur und -Typen und Genregulierung und Epigenetik her, da viele kleine RNAs an Regelkreisen mit Transkriptionsfaktoren und epigenetischen Modifikatoren beteiligt sind. Das Verständnis der Biogenese kleiner RNA basiert auch auf Konzepten der Transkription und RNA-Verarbeitung, insbesondere der Rolle von Drosha und Dicer bei der miRNA-Reifung.
Praktisches Protokoll
Die Vorbereitung einer kleinen RNA-Seq-Bibliothek beginnt mit der gesamten RNA-Eingabe (100–1000 ng). Die Auswahl der Größe ist entscheidend: RNA-Fragmente von 18–35 nt werden durch Gelexzision aus einem 15 %igen Polyacrylamidgel oder durch Bead-basierte Reinigung mit AMPure XP-Beads bei spezifischen PEG-Konzentrationen isoliert. Die Adapterligation verwendet verkürzte T4-RNA-Ligase 2 für den 3’-Adapter (Minimierung der Zirkularisierung) und T4-RNA-Ligase 1 für den 5’-Adapter. Nach der umgekehrten Transkription mit SuperScript III wird die cDNA per PCR amplifiziert (12–15 Zyklen, um eine Überamplifikation zu vermeiden) und erneut einer Größenselektion unterzogen, um Adapterdimere zu entfernen. Zur Vorverarbeitung schneidet „Cutadapt“ Adaptersequenzen präzise zu: „cutadapt -a TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG –discard-untrimmed -m 18 -M 35 -o trimmed.fastq raw.fastq“. Das Flag „–discard-untrimmed“ entfernt Lesevorgänge ohne erkennbaren Adapter. Für die Entdeckung und Quantifizierung von miRNA bietet „miRDeep2“ eine umfassende Pipeline: Führen Sie „mapper.pl“ aus, um Lesevorgänge zu verarbeiten, „miRDeep2.pl“, um bekannte und neue miRNAs gegen miRBase zu identifizieren, und „quantifier.pl“, um die Expression zu quantifizieren. Die Pipeline bewertet mögliche miRNA-Vorläufer durch Bewertung der charakteristischen Haarnadelstruktur: Ein miRDeep2-Score über 10 weist auf eine hohe Zuverlässigkeit der Vorhersagen hin. Zu den alternativen Tools gehören „sRNAbench“ für Arten mit unvollständigen miRBase-Annotationen und „ShortStack“ für die De-novo-Entdeckung kleiner RNA ohne Referenzgenom. Die Normalisierung kleiner RNA-Expressionsdaten erfordert besondere Aufmerksamkeit; Zu den Optionen gehören TPM (Transkripte pro Million), Lesevorgänge pro Million (RPM) oder die Verwendung von Spike-In-Kontrollen wie synthetischem Cel-MiR-39. Eine differenzielle Expressionsanalyse kann mit „DESeq2“ an Zähldaten durchgeführt werden, aber die Größenfaktorschätzung sollte nur miRNA-Zählungen und nicht die gesamten kartierten Lesevorgänge verwenden, um Verzerrungen durch häufig vorkommende kleine Nicht-miRNA-RNAs zu vermeiden.
