La PCR digital (dPCR) es un refinamiento de la PCR convencional que proporciona una cuantificación absoluta de ácidos nucleicos sin necesidad de una curva estándar. La muestra se divide en miles de pequeñas reacciones individuales y, después de la amplificación, se cuenta el número de particiones positivas y negativas.
Cómo funciona la PCR digital
- Partición
La mezcla de PCR que contiene la muestra, los cebadores, la sonda y la polimerasa se divide en miles de particiones del tamaño de nanolitros. Esto se puede hacer usando un chip con micropocillos, gotas en una emulsión de aceite (PCR digital de gotas) u otros métodos. Cada partición contiene cero o al menos una copia del ADN objetivo.
- Amplificación
La muestra dividida se somete a un ciclo térmico estándar. En cada partición, la PCR se desarrolla de forma independiente. Las particiones que contienen ADN objetivo producen un producto amplificado, mientras que las particiones vacías no producen ninguno.
- Detección del punto final
Después de la amplificación, se analiza la fluorescencia de cada partición. Las particiones que contienen ADN diana amplificado se califican como positivas (fluorescentes), mientras que las que no lo contienen se califican como negativas. No se necesita ningún ciclo de cuantificación (Ct); es simplemente una lectura de sí o no por partición.
- Estadísticas de veneno
Dado que la partición es aleatoria, algunas particiones pueden contener varias copias del objetivo. Las estadísticas de Poisson se utilizan para calcular el número absoluto de moléculas diana en la muestra original en función de la proporción de particiones negativas.
- Aplicaciones
La PCR digital es muy precisa y se utiliza para cuantificar mutaciones raras, detectar patógenos de baja abundancia, analizar variaciones en el número de copias y verificar los resultados de NGS. Es menos sensible a los inhibidores de la PCR que qPCR y proporciona una cuantificación absoluta sin estándares.
Flujo de trabajo práctico de dPCR
Prepare la mezcla maestra de PCR que contiene la muestra de ADN (1 a 100 ng), cebadores, sonda y aceite de generación de gotas. Para la PCR digital de gotas (ddPCR), cargue la mezcla en un generador de gotas que divide la muestra en ~20.000 gotas uniformes de nanolitros en una emulsión de agua en aceite. Para la dPCR basada en chip, la muestra se carga en un chip de microfluidos con micropocillos prefabricados (normalmente ~20 000 pocillos). Transfiera la muestra dividida a un ciclador térmico y amplifique hasta el punto final utilizando condiciones de ciclo estándar. Después de la amplificación, lea la fluorescencia de cada partición utilizando un lector dedicado. Las particiones con ADN objetivo muestran fluorescencia por encima de un umbral establecido manualmente y se califican como positivas. Aplique la estadística de Poisson: λ = −ln(1 − p) donde p es la fracción de particiones positivas; la concentración objetivo absoluta (copias/μL) es λ dividida por el volumen de partición. Utilice al menos 10 000 particiones aceptadas para una cuantificación confiable. Incluya un control sin plantilla y un control positivo con un número de copias conocido. Para la detección de mutaciones raras, utilice sondas fluorescentes duales (una sonda de tipo salvaje marcada con FAM y una sonda mutante con HEX) para distinguir las moléculas mutantes de las de tipo salvaje en la misma reacción.
Aplicación del mundo real
En la biopsia líquida para el seguimiento del cáncer, la ddPCR detecta mutaciones del ADN tumoral circulante (ctDNA), como EGFR T790M en el cáncer de pulmón de células no pequeñas. El ADN plasmático (10 ng) se extrae de la sangre y se analiza con sondas específicas para mutaciones. ddPCR resuelve frecuencias de alelos mutantes tan bajas como 0,01%, muy por debajo del límite de detección de la secuenciación de Sanger. Se calcula el número absoluto de copias de moléculas mutantes por ml de plasma, lo que permite el seguimiento longitudinal de la carga tumoral y la detección temprana de la resistencia al tratamiento.
