La secuenciación de Sanger, también conocida como secuenciación de terminación de cadena, es un método utilizado para determinar el orden exacto de los nucleótidos en una molécula de ADN. Desarrollado por Frederick Sanger en 1977, sigue siendo el estándar de oro para validar secuencias de ADN y detectar mutaciones.
Cómo funciona la secuenciación de Sanger
- Preparando la reacción
El ADN que se va a secuenciar se mezcla con un cebador de ADN, ADN polimerasa, nucleótidos normales (dNTP) y una pequeña cantidad de didesoxinucleótidos marcados con fluorescencia (ddNTP). Cada uno de los cuatro ddNTP está etiquetado con un tinte fluorescente diferente.
- Terminación de la cadena
La reacción comienza con la unión del cebador al ADN molde. La ADN polimerasa extiende el cebador añadiendo dNTP. Siempre que se incorpora un ddNTP en lugar de un dNTP, la cadena deja de crecer porque los ddNTP carecen del grupo 3’-hidroxilo necesario para una mayor extensión.
- Generación de fragmentos
Este proceso produce una mezcla de fragmentos de ADN de diferentes longitudes, cada uno de los cuales termina en una posición de nucleótido específica. La etiqueta fluorescente en el ddNTP terminal identifica qué base está al final de cada fragmento.
- electroforesis capilar
La mezcla se carga en un instrumento de electroforesis capilar, donde la separación basada en el tamaño se realiza mediante electroforesis en gel capilar. Los fragmentos migran a través de una matriz polimérica dentro del capilar y se detectan mediante fluorescencia inducida por láser cuando pasan por la ventana de detección. Un láser excita las etiquetas fluorescentes y un detector registra qué color pasa en cada momento.
- Análisis de cromatograma
El instrumento produce un cromatograma: una serie de picos coloreados que representan la secuencia de nucleótidos. La secuencia se lee en el cromatograma, normalmente desde el fragmento más corto hasta el más largo, dando la secuencia de ADN completa.
Flujo de trabajo práctico de secuenciación de Sanger
Prepare el ADN plantilla purificando el producto de PCR o el plásmido utilizando un kit de limpieza de columnas. Para la secuenciación de plásmidos, utilice entre 200 y 500 ng de plásmido purificado; para productos de PCR, utilice de 1 a 10 ng por 100 pb de amplicón. Configure la reacción de secuenciación del ciclo en un volumen de 10 l: 2 l de BigDye Terminator v3.1 Ready Reaction Mix, 2 l de tampón de secuenciación 5×, 1 l de cebador (3,2 pmol/l), ADN plantilla y agua hasta 10 l. Utilice el siguiente programa de ciclo térmico: 96 °C durante 1 minuto, luego 25 ciclos de 96 °C durante 10 segundos, 50 °C durante 5 segundos y 60 °C durante 4 minutos. Purifique los productos de extensión mediante precipitación con etanol o una limpieza con perlas magnéticas para eliminar los terminadores de tinte no incorporados. Cargue la muestra purificada en un instrumento de electroforesis capilar (por ejemplo, Applied Biosystems 3730). La prueba separa los fragmentos por tamaño y un láser excita los tintes fluorescentes a medida que los fragmentos pasan la ventana de detección. Examine el cromatograma resultante utilizando software como FinchTV, SnapGene o Chromas. Los datos de buena calidad suelen extenderse entre 600 y 900 bases desde el cebador. Compruebe si hay picos limpios y espaciados uniformemente con resolución de referencia. Los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) aparecen como dos picos superpuestos en la misma posición. La mala calidad al principio (primeras 20 a 40 bases) y al final (después de 800 bases) es normal; recorte estas regiones antes del análisis. Solucione los problemas de reacciones fallidas aumentando la plantilla, rediseñando los cebadores con Tm de 60 a 65 °C o agregando DMSO (2 a 5 %) para plantillas ricas en GC.
Aplicación del mundo real
Para confirmar un gen editado con CRISPR en embriones de ratón, la región objetivo se amplifica por PCR y se secuencia con Sanger. El cromatograma muestra picos mixtos cerca del sitio de corte, lo que indica indeles. El análisis ICE descompone el rastro e informa una eficiencia de edición del 72 % con una inserción de 1 pb como el alelo más común. La secuenciación de Sanger sigue siendo el estándar de oro para validar las ediciones del genoma debido a su precisión y rentabilidad.
