La inclusión es el paso que presenta el tejido procesado en la orientación correcta para el corte. Los biobancos garantizan que el tejido, los bloques y los portaobjetos sobrantes se conserven en condiciones que mantengan su valor de diagnóstico e investigación durante décadas.
El proceso de incrustación
La inclusión convierte el tejido infiltrado en un bloque de parafina sólido que se puede sujetar en un portabrocas de micrótomo. El proceso utiliza un centro de inclusión: una plataforma calentada (60-65 °C) con dispensadores de parafina fundida, una placa fría (-5 a -10 °C) para una solidificación rápida y unas pinzas calentadas a la misma temperatura que la parafina.
Pasos: se llena un molde metálico (molde base) del tamaño adecuado con parafina fundida. La sección de tejido se transfiere del casete a la parafina utilizando unas pinzas calentadas. El tejido se orienta de manera que la superficie a seccionar mire hacia abajo (la parte inferior del molde se convierte en la superficie de corte). El casete de tejido etiquetado se coloca encima del molde y se dispensa parafina adicional para llenar el casete. El molde se coloca sobre la placa fría; la solidificación comienza en 2-3 minutos. Después del endurecimiento completo (5-10 minutos), se retira el bloque del molde.
Orientación por tipo de tejido
La orientación correcta maximiza la información de diagnóstico. Escisiones de piel: incrustadas en el borde para mostrar la epidermis, la dermis y el tejido subcutáneo en una sola sección. Biopsias gastrointestinales: incluidas en el borde para mostrar el espesor completo de la mucosa desde el epitelio de la superficie hasta la muscular de la mucosa. Biopsias con aguja gruesa: incrustadas paralelamente a la superficie de corte, múltiples núcleos alineados en paralelo en el mismo plano. Biopsias fragmentadas pequeñas: envueltas en papel para lentes o preincrustadas en agar antes del procesamiento para evitar la pérdida de pequeños fragmentos.
Evaluación de márgenes requiere la incrustación frontal (perpendicular) de las secciones de margen de modo que la superficie entintada se seccione en la cara de corte. Ganglios linfáticos: bisecados si >5 mm; superficie de corte incrustada hacia abajo para maximizar el parénquima nodal en la sección.
Almacenamiento de bloques de parafina
Los bloques de parafina son el principal material de archivo en histopatología. Se almacenan indefinidamente a temperatura ambiente: la parafina es químicamente inerte y los bloques permanecen seccionables durante décadas. Condiciones de almacenamiento: fresco (15-25°C), seco (evite la humedad que favorece el moho) y oscuro (la luz degrada algunos antígenos). Los bloques se almacenan en sistemas de archivo etiquetados (numéricamente por número de acceso) en gabinetes ignífugos. El período de retención de los bloques de parafina varía según la jurisdicción: normalmente de 10 a 20 años para los bloques de diagnóstico; Los bloques de expedientes docentes y de investigación podrán conservarse por tiempo indefinido.
Construcción de microarrays de tejido
Los microarrays de tejidos (TMA) permiten el análisis simultáneo de cientos de muestras de tejido en un solo portaobjetos. Un matriz TMA extrae núcleos de 0,6 a 2,0 mm de bloques de parafina del donante (regiones de interés seleccionadas, por ejemplo, centro del tumor, margen invasivo) y los vuelve a incrustar en un bloque receptor en un patrón de cuadrícula. Las secciones del TMA se pueden teñir con H&E, IHC o hibridación in situ para un análisis de alto rendimiento. Los TMA se utilizan ampliamente para la validación de biomarcadores, la optimización de IHC y la investigación.
Biobanco de tejidos congelados
El tejido congelado es el estándar de oro para el análisis molecular porque la congelación preserva el ARN, el ADN y las proteínas sin la degradación causada por la fijación con formalina. Protocolo: el tejido fresco (recolectado entre 20 y 30 minutos después de su extracción) se corta en trozos de 5 a 10 mm, se coloca en un criovial y se congela rápidamente en nitrógeno líquido o isopentano enfriado en hielo seco. El tejido congelado se almacena a -80°C o en fase de vapor de nitrógeno líquido (-150°C). El compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) se utiliza para incrustar tejido congelado para el corte en criostato.
Los indicadores de calidad para los biobancos congelados incluyen: tiempo de isquemia fría (minutos), ciclos de congelación y descongelación (minimizar), temperatura de almacenamiento y número de integridad del ARN (RIN > 7 para la mayoría de las aplicaciones moleculares). Control H&E: cada bloque congelado debe tener una sección teñida con H&E para verificar el contenido y la calidad del tejido.
Tejido fijado en formalina e incluido en parafina (FFPE) para investigación
El tejido FFPE es el recurso más abundante para la investigación retrospectiva porque los bloques de diagnóstico están universalmente disponibles. Los ácidos nucleicos extraídos del tejido FFPE están fragmentados y modificados químicamente (desaminación, entrecruzamientos), pero son suficientes para PCR, secuenciación dirigida e IHC. El ADN de FFPE es adecuado para la mayoría de los ensayos moleculares con amplicones de hasta 300 pares de bases. El ARN de FFPE está más degradado: es adecuado para análisis de expresión genética específicos, pero no para estudios de todo el transcriptoma sin protocolos especializados.
Consideraciones éticas y regulatorias
Los biobancos requieren consentimiento informado para el uso de tejido excedente en investigaciones. Muchas instituciones operan bajo un modelo de consentimiento amplio en el que los pacientes dan su consentimiento para futuras investigaciones no especificadas. La anonimización elimina los identificadores directos; desidentificación reemplaza los identificadores con un código. El uso en investigación de tejido de diagnóstico sin consentimiento requiere la aprobación del comité de ética. Las regulaciones (HIPAA en EE. UU., GDPR en Europa, Ley de Tejidos Humanos en el Reino Unido) rigen el almacenamiento, la transferencia y el uso de investigación de tejidos. Los programas de garantía de calidad de laboratorio incluyen auditorías periódicas del almacenamiento de bloques, la precisión del etiquetado y los tiempos de recuperación.
