La hematoxilina y eosina (H&E) es la tinción más utilizada en histopatología y se aplica prácticamente a todas las secciones de tejido de diagnóstico. Comprender su química, las variaciones de formulación y los problemas comunes es esencial para producir [portaobjetos de diagnóstico] de alta calidad (/guides/histological-staining-techniques.html).
Química de la hematoxilina
La hematoxilina es un tinte natural extraído del duramen del palo de Campeche (Haematoxylon campechianum). No es en sí mismo un tinte; debe oxidarse a hemateína, el agente colorante activo. La oxidación se produce de forma natural con la exposición al aire y la luz (maduración) o de forma artificial mediante oxidantes químicos (yodato de sodio, óxido de mercurio). La hemateína se une a mordientes metálicos (aluminio, hierro, tungsteno) para formar complejos de lacas coloreadas que unen los componentes del tejido.
Las hematoxilinas de alumbre (Harris, Gill, Mayer, Gill II) utilizan sales de aluminio como mordientes y tiñen los núcleos de azul. La hematoxilina de Harris utiliza óxido mercúrico como oxidante y se madura; Produce detalles nucleares nítidos, pero requiere filtración antes de su uso para eliminar el mercurio precipitado. La hematoxilina de branquias utiliza yodato de sodio como oxidante químico y está lista para usar sin madurar; es más estable y produce resultados consistentes. La hematoxilina de Mayer es similar pero más diluida y requiere tiempos de tinción más prolongados.
Química de la eosina
La eosina es un tinte de xanteno disponible en dos formas: eosina Y (amarillenta, la más común) y eosina B (azulada). La eosina Y es soluble en agua y se utiliza en soluciones acuosas o alcohólicas. Es un tinte ácido que une componentes tisulares básicos (catiónicos): proteínas citoplasmáticas, colágeno, glóbulos rojos y gránulos secretores. Las soluciones de eosina suelen contener ácido acético para mejorar la tinción de los glóbulos rojos y evitar la tinción excesiva del colágeno.
Protocolo de tinción H&E
La tinción automatizada H&E procesa portaobjetos a través de baños secuenciales: desparafinización (xileno, 3 cambios), hidratación (etanoles graduados del 100% al 70%, luego agua), hematoxilina (3-8 minutos dependiendo de la formulación y la intensidad deseada), azulado (agua del grifo de Scott o agua con amoníaco, que cambia la hematoxilina de rojo a azul a pH alcalino), eosina (1-3 minutos), deshidratación (etanoles graduados del 70% al 100%), aclarado (xileno) y cubrición con medio de montaje permanente. El tiempo total del ciclo en un teñidor automático es de aproximadamente 30 a 45 minutos.
Solución de problemas de H&E
Tinción nuclear pálida o débil: la hematoxilina puede estar agotada (reemplazarla), la concentración de mordiente puede ser baja o el tiempo de tinción es insuficiente. Compruebe si la hematoxilina se ha oxidado más allá de su vida útil (la hematoxilina demasiado madura se vuelve marrón oscuro y se tiñe mal). La descalcificación excesiva de muestras óseas también reduce la basofilia nuclear.
Núcleos turbios o demasiado teñidos: el tiempo de tinción con hematoxilina es demasiado largo, el paso de azulado es insuficiente o la solución de hematoxilina está demasiado concentrada. Diferenciar el grosor de la sección que es demasiado grueso (las secciones deben tener entre 3 y 5 µm).
La eosina supera a la hematoxilina: concentración de eosina demasiado alta, pH de eosina demasiado ácido o hematoxilina demasiado débil. Reducir el tiempo de eosina o aumentar el tiempo de hematoxilina. La intensidad variable de eosina en toda la sección sugiere un [procesamiento de tejidos] desigual (/guides/tissue-processing-and-sectioning.html).
Tonos azules excesivos: diferenciación insuficiente en alcohol ácido (HCl al 1% en etanol al 70%) o tiempo de eosina inadecuado. Comprobar que no se ha agotado el alcohol ácido.
Tinción nuclear y citoplasmática débil: espesor de la sección demasiado fino (menos de 3 µm), tejido demasiado fijado en formalina o desparafinización inadecuada (prórroga de xileno a hematoxilina acuosa).
Control de calidad
El control de calidad diario para H&E incluye un portaobjetos de control (tejido con detalles nucleares y citoplasmáticos conocidos: amígdalas o colon), evaluación del contraste nuclear/citoplasmático, uniformidad en todo el portaobjetos, ausencia de precipitado y cubreobjetos adecuado sin burbujas. Documentar los resultados de control de calidad y las acciones correctivas. Las soluciones de H&E deben cambiarse según un cronograma (hematoxilina cada 1-2 semanas o después de 500-1000 portaobjetos; eosina cada 1-2 semanas). El mantenimiento regular del equipo de tinción (limpieza de rejillas, verificación de niveles de líquido, calibración de temporizadores) evita fallas en los lotes.
