La extracción y purificación de proteínas son técnicas esenciales para aislar una proteína específica de una mezcla compleja de componentes celulares. Las proteínas purificadas son necesarias para estudios estructurales, ensayos enzimáticos, producción de anticuerpos y aplicaciones terapéuticas.
Cómo funciona la extracción y purificación de proteínas
- Lisis celular
El primer paso es abrir las células para liberar su contenido. Esto se hace mediante métodos mecánicos como homogeneización, sonicación o batido de perlas, a menudo en presencia de un tampón de lisis que contiene inhibidores de proteasa para evitar la degradación de proteínas.
- Aclaración
El lisado se centrifuga para sedimentar restos insolubles, incluidas membranas celulares y orgánulos. Se recoge el sobrenadante que contiene las proteínas solubles. Este lisado clarificado es el material de partida para la purificación.
- Precipitación o Fraccionamiento
A veces se utiliza un paso de enriquecimiento inicial. La precipitación con sulfato de amonio precipita selectivamente las proteínas en función de su solubilidad. La centrifugación diferencial puede separar proteínas por tamaño en un gradiente de densidad.
- Cromatografía
El método de purificación más potente es la cromatografía en columna, que separa las proteínas en función de diferentes propiedades:
- Cromatografía de afinidad: un ligando o anticuerpo específico en la columna se une a la proteína objetivo.
- Cromatografía de intercambio iónico: Las proteínas se separan por su carga neta.
- Cromatografía de exclusión por tamaño: Las proteínas se separan por su tamaño y forma.
- elución y recogida
La proteína objetivo se libera de la columna cambiando las condiciones del tampón: alterando la concentración de sal, el pH o agregando un ligando competidor. La proteína purificada se recoge en fracciones y se analiza su pureza.
- Control de calidad
La proteína purificada se analiza mediante SDS-PAGE o electroforesis en gel capilar (CGE) para comprobar su tamaño y pureza. Western blotting confirma su identidad. La concentración se mide mediante un ensayo de cuantificación de proteínas.
Protocolo práctico de extracción de proteínas y purificación de etiquetas His
Coseche las células (1 × 10⁷ células de mamífero o 50 ml de cultivo bacteriano) mediante centrifugación a 500 × g durante 5 minutos. Lavar el pellet con PBS helado. Resuspender en 500 ml de tampón de lisis RIPA (Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, Triton X-100 al 1%, desoxicolato de sodio al 0,5%, SDS al 0,1%) recién suplementado con 1 x cóctel inhibidor de proteasa y PMSF 1 mM. Para las células bacterianas que expresan una proteína marcada con His, utilice un tampón de lisis desnaturalizante (urea 8 M, NaH2PO4 100 mM, Tris-HCl 10 mM pH 8,0) o tampón nativo (NaH2PO4 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 10 mM pH 8,0). Lise las células mediante sonicación en hielo: 3 pulsos de 15 segundos al 30% de amplitud con intervalos de enfriamiento de 30 segundos. Centrifugar a 15.000 × g durante 30 minutos a 4°C y recoger el sobrenadante. Equilibrar 1 ml de resina de agarosa Ni-NTA en una columna de gravedad con 10 volúmenes de columna de tampón de unión. Aplicar el lisado clarificado y recoger el flujo. Lavar con 10 volúmenes de columna de tampón de lavado (tampón de unión con imidazol 20–50 mM). Eluir la proteína marcada con His en fracciones de 5 × 1 ml utilizando tampón de elución (tampón de unión con imidazol 250 mM). Analizar 20 l de cada fracción (lisado, flujo, lavado, eluciones) mediante SDS-PAGE al 12%. Tiñe con azul de Coomassie para visualizar la proteína objetivo: una sola banda con el peso molecular esperado en las fracciones de elución indica una purificación exitosa. Para mayor pureza, combine las fracciones de elución y ejecútelas en una columna de cromatografía de exclusión por tamaño (Superdex 200) equilibrada con tampón de almacenamiento (Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, glicerol al 10%).
Aplicación del mundo real
Se expresa una quinasa humana marcada con His 6X (MAPK14/p38α, 41 kDa) en E. coli BL21(DE3) con inducción de IPTG 0,5 mM durante 4 horas a 30°C. Después de la purificación con Ni-NTA, SDS-PAGE muestra una banda prominente de 41 kDa en fracciones de elución con >90 % de pureza. La proteína se concentra a 5 mg/ml, se congela instantáneamente en nitrógeno líquido y retiene >80% de actividad quinasa en un ensayo de fosforilación.
