La histopatología es el examen microscópico del tejido enfermo. Antes de que un patólogo pueda evaluar una muestra, el tejido debe someterse a una serie de pasos preparativos que preserven la estructura, endurezcan la muestra para cortarla y produzcan secciones lo suficientemente delgadas como para transmitir luz. La calidad del diagnóstico final depende directamente de la calidad del procesamiento y corte.
Fijación
La fijación preserva la arquitectura del tejido al entrecruzar proteínas e inactivar enzimas degradativas. El fijador más común es la formalina tamponada neutra (NBF) al 10 %, una solución de formaldehído al 3,7 % que forma puentes de metileno entre los grupos amino, estabilizando la estructura de la proteína sin una contracción excesiva. El tiempo de fijación depende del tamaño del tejido: una biopsia típica requiere de 6 a 24 horas, mientras que las muestras más grandes pueden necesitar de 24 a 48 horas. La fijación insuficiente deja el tejido vulnerable a la autólisis y produce secciones mal teñidas; la fijación excesiva provoca una reticulación excesiva que enmascara los antígenos para la inmunohistoquímica. Otros fijadores incluyen glutaraldehído (para microscopía electrónica), solución de Bouin (para tejidos endocrinos) y fijadores a base de alcohol (para procesamiento rápido en secciones congeladas).
Procesamiento
Después de la fijación, el tejido debe infiltrarse con un medio de soporte sólido (normalmente cera de parafina) antes de seccionarlo. El procesamiento se produce en un procesador de tejidos automatizado durante 12 a 24 horas a través de etapas secuenciales:
La deshidratación elimina el agua del tejido utilizando etanoles graduados (70 %, 80 %, 95 %, 100 %) para evitar la distorsión. La deshidratación incompleta impide la penetración de la cera y provoca artefactos de corte.
Aclaramiento reemplaza el etanol con un solvente orgánico miscible tanto con alcohol como con parafina. El xileno es el agente clarificante más común; hace que el tejido sea translúcido y lo prepara para la infiltración.
Infiltración reemplaza el agente limpiador con cera de parafina fundida en un horno de vacío, asegurando una penetración completa en todo el bloque de tejido. La aspiradora elimina las burbujas de aire que de otro modo provocarían agujeros en las secciones.
Incrustación
La inclusión orienta el tejido infiltrado en un bloque de parafina para su corte. El tejido se coloca en un molde de metal, se cubre con cera fundida y se enfría en una placa fría hasta que esté sólido. La orientación correcta es fundamental: la mayoría de las biopsias se incluyen para presentar el área transversal máxima a la hoja del micrótomo. Las muestras pequeñas o fragmentadas (biopsias con aguja, bloques de células de citología) a menudo se envuelven en papel para lentes o se incrustan en agar antes de procesarlas para evitar su pérdida.
Microtomía
La sección se realiza en un microtomo rotatorio que hace avanzar el bloque de parafina en incrementos precisos, normalmente de 3 a 5 µm para la histología de rutina. La cinta de secciones flota en un baño de agua caliente (40-45°C) para aplanar las arrugas y luego se recoge en portaobjetos de vidrio. Los factores que afectan la calidad de la sección incluyen la condición de la cuchilla (las cuchillas desechables se cambian periódicamente), la temperatura del bloque (enfriar los bloques en hielo mejora la sección de los tejidos grasos) y la velocidad de corte (los trazos lentos y uniformes producen las mejores cintas).
Después del montaje, las secciones se secan en una placa caliente o en un horno para asegurar la adhesión. La tinción posterior (más comúnmente H&E - hematoxilina y eosina) revela detalles nucleares y citoplasmáticos para la evaluación microscópica.
Artefactos comunes
Las marcas de cuchillo aparecen como líneas de corte paralelas provenientes de muescas en la hoja del micrótomo; se pueden minimizar utilizando bordes de cuchilla nuevos para tejidos duros.
La compresión ocurre cuando el bloque está demasiado caliente o la hoja está desafilada, lo que hace que la sección sea más corta que la cara del bloque. Esto se soluciona enfriando el bloque o reemplazando la cuchilla.
El Chatter (bandas gruesas y finas alternadas) resulta de la vibración en el microtomo o de un bloque suelto; el bloque debe estar firmemente asegurado en el portabrocas.
Los pliegues y arrugas en la sección son causados por una flotación inadecuada en el baño de agua o por un calor excesivo; Agregar una gota de detergente al agua reduce la tensión superficial.
Los artefactos flotantes son fragmentos de tejido de otros casos que contaminan el baño de agua; filtrar el baño de agua y cambiarlo diariamente evita la contaminación cruzada.
Las burbujas surgen de una infiltración incompleta de parafina durante el procesamiento, lo que deja aire atrapado en el tejido. Puede ser necesario un reprocesamiento al vacío.
Control de calidad
En cada portaobjetos teñido se debe comprobar el grosor de la sección (uniforme de 3 a 5 µm), la ausencia de pliegues y desgarros, la representación completa del tejido y el etiquetado correcto. Las secciones inadecuadas deben volver a cortarse antes de que el patólogo revise el caso. El procesamiento y el corte adecuados son requisitos previos para un diagnóstico histopatológico preciso y para técnicas posteriores como la inmunohistoquímica, la hibridación in situ y la patología digital.
