A eletroforese capilar (CE) é uma família de métodos de separação eletrocinética realizados em capilares estreitos de sílica fundida com diâmetros internos de 25 a 100 micrômetros. Um campo elétrico de 100 a 500 V/cm é aplicado através do capilar, conduzindo analitos carregados em direção ao eletrodo oposto a taxas determinadas por sua mobilidade eletroforética. A CE combina alta eficiência de separação (frequentemente excedendo 100.000 pratos teóricos) com tempos de análise curtos, consumo mínimo de amostra (nanolitros) e compatibilidade com tampões aquosos e não aquosos. Ela se tornou uma plataforma essencial na análise farmacêutica, diagnósticos clínicos, ciência forense, proteômica e metabolômica, oferecendo um mecanismo de separação ortogonal tanto à cromatografia líquida quanto à eletroforese em gel.
O Princípio da Mobilidade Eletroforética
Quando um campo elétrico é aplicado a uma solução, uma partícula carregada experimenta uma força eletrostática proporcional à sua carga líquida (q) e à intensidade do campo (E). A partícula acelera até que a força de arrasto do meio circundante se iguale à força eletrostática, momento em que migra a uma velocidade constante. A mobilidade eletroforética (µ_ep) é definida como a velocidade por unidade de intensidade de campo e é proporcional a q dividido pelo raio hidrodinâmico (r) da partícula. Íons pequenos e altamente carregados têm alta mobilidade, enquanto espécies grandes ou fracamente carregadas migram mais lentamente. Essa migração diferencial é a base de todas as separações eletroforéticas.
Fluxo Eletrosmótico
O fluxo eletrosmótico (EOF) é um fenômeno distintivo na CE que surge da dupla camada elétrica na parede do capilar de sílica fundida. Em pH acima de aproximadamente 3, grupos silanol na superfície interna do capilar são desprotonados, criando uma parede com carga negativa. Cátions do tampão se acumulam perto da parede formando uma dupla camada elétrica difusa. Quando o campo elétrico é aplicado, esses cátions hidratados migram em direção ao cátodo, arrastando a solução principal consigo. O perfil de EOF resultante é quase plano (em forma de plugue), em contraste com o perfil de fluxo parabólico dos sistemas acionados por pressão, como a HPLC. Esse fluxo plugue minimiza o alargamento da zona, contribuindo para as eficiências de separação excepcionalmente altas observadas na CE. A magnitude e a direção do EOF dependem do pH do tampão, da força iônica e da química da parede do capilar, e podem ser suprimidas ou invertidas através de revestimentos de parede ou modificadores dinâmicos.
Instrumentação
Um instrumento de CE consiste em uma fonte de alimentação de alta tensão (tipicamente 0 a 30 kV), dois reservatórios de tampão com eletrodos de platina, um capilar de sílica fundida (25 a 100 cm de comprimento) e um detector. O capilar passa através do detector, permitindo a detecção na coluna sem a necessidade de tubulação de derivação pós-coluna. A introdução da amostra é realizada substituindo um reservatório de tampão pelo vial de amostra e aplicando pressão (injeção hidrodinâmica) ou tensão (injeção eletrocinética) por um tempo definido. A injeção hidrodinâmica é preferida para trabalho quantitativo porque o volume introduzido é independente da matriz da amostra, enquanto a injeção eletrocinética introduz um viés em direção a analitos mais móveis, mas pode alcançar maior sensibilidade para componentes traço.
Modos de Detecção
A detecção por absorbância UV-Vis é o método de detecção CE mais comum, tipicamente realizada através de uma janela criada pela remoção do revestimento de poliimida do capilar. A absorbância é medida através do diâmetro do capilar, o que limita o comprimento do caminho óptico ao diâmetro interno do capilar (25 a 100 µm), resultando em sensibilidade modesta (baixa micromolar). A detecção por fluorescência induzida por laser (LIF) fornece sensibilidade dramaticamente maior (níveis de attomol a zeptomol) para analitos marcados fluorescentemente, tornando-a o método de escolha para sequenciamento de DNA e análise de traços. A detecção eletroquímica (amperometria e condutividade) é usada para espécies eletroativas e pequenos íons inorgânicos. A CE acoplada à espectrometria de massas (CE-MS) via ionização por electrospray fornece tanto alta eficiência de separação quanto identificação estrutural, e é amplamente empregada em proteômica e metabolômica para análise de peptídeos, proteínas e metabólitos polares.
Os Modos de Separação
A CE abrange vários modos operacionais que exploram diferentes mecanismos de separação. A eletroforese capilar de zona (CZE) separa analitos com base em sua relação carga-tamanho em solução livre e é o modo mais amplamente utilizado. A eletroforese capilar em gel (CGE) usa um gel polimérico ou matriz polimérica linear para separar moléculas por tamanho, e é a plataforma padrão para sequenciamento de DNA e perfilamento de DNA forense. O focamento isoelétrico capilar (CIEF) separa moléculas anfóteras como proteínas de acordo com seu ponto isoelétrico (pI) em um gradiente de pH. A isotacoforese capilar (CITP) usa um sistema de tampão descontínuo para focar analitos em zonas nítidas e concentradas, e é frequentemente usada para pré-concentração de amostras antes da CZE. A cromatografia eletrocinética micelar (MEKC) introduz micelas de surfactante como uma fase pseudo-estacionária, permitindo a separação de analitos neutros por partição hidrofóbica. A escolha do modo depende da natureza dos analitos e dos objetivos de separação.
Comparação com HPLC
CE e HPLC são técnicas de separação complementares. A HPLC separa analitos com base na partição entre uma fase estacionária e uma fase móvel, enquanto a CE separa com base em diferenças na mobilidade eletroforética em solução livre. A CE tipicamente oferece maior número de pratos (100.000 a 500.000 pratos por metro) do que a HPLC, mas menor sensibilidade de concentração devido ao curto comprimento do caminho óptico e aos pequenos volumes de injeção. A CE é particularmente vantajosa para espécies carregadas, polares e iônicas que podem ser difíceis de reter em colunas HPLC de fase reversa. O desenvolvimento de métodos em CE é simplificado pela ampla gama de modos de separação e pela capacidade de manipular a seletividade através da composição do tampão, pH e aditivos sem a necessidade de trocar colunas.
