A eletroforese de zona capilar (CZE) é o modo mais fundamental e amplamente praticado da eletroforese capilar. Na CZE, o capilar é preenchido com um eletrólito de fundo (BGE) contínuo e uniforme, e a amostra é introduzida como um plugue estreito na extremidade de entrada. Sob a influência do campo elétrico aplicado, cada analito migra com sua velocidade característica, determinada pela soma de sua mobilidade eletroforética e do fluxo eletrosmótico (EOF). Analitos que diferem em carga ou tamanho migram em velocidades diferentes e são resolvidos em zonas discretas à medida que viajam em direção ao detector. A CZE é aplicada em uma ampla gama de classes de analitos, desde pequenos íons inorgânicos e produtos farmacêuticos até peptídeos, proteínas e fragmentos de ácidos nucleicos.
O Mecanismo de Separação por Zonas
A velocidade de migração líquida de um analito na CZE é a soma vetorial de sua velocidade eletroforética (em direção ao eletrodo de carga oposta) e da velocidade eletrosmótica (normalmente em direção ao cátodo). Em pH acima de 3, o EOF é geralmente mais forte que a mobilidade eletroforética da maioria dos ânions, então todos os analitos — cátions, neutros e ânions — são arrastados em direção ao detector na extremidade do cátodo. Os cátions migram mais rapidamente porque sua migração eletroforética está na mesma direção que o EOF. Os analitos neutros migram na velocidade do EOF e co-eluem como um único pico não resolvido, razão pela qual a CZE não é adequada para espécies neutras sem modificação. Os ânions migram mais lentamente porque sua migração eletroforética se opõe ao EOF, e aqueles com mobilidades maiores que o EOF na direção oposta nunca atingem o detector. A janela de separação é definida pelo tempo de migração de um marcador neutro (t_EOF) e pelo tempo em que o ânion mais lento emerge.
Composição do Tampão e Seletividade
A escolha do BGE é a ferramenta mais poderosa para controlar a seletividade na CZE. O pH do tampão determina o estado de ionização de analitos ácidos e básicos e, portanto, sua carga efetiva e mobilidade. Para separações de peptídeos e proteínas, o pH é ajustado para um valor onde as espécies de interesse tenham cargas líquidas significativamente diferentes, tipicamente na faixa de 2 a 9. A força iônica do tampão afeta tanto a magnitude do EOF quanto a espessura da dupla camada elétrica; maior força iônica reduz o EOF e comprime a dupla camada, melhorando a resolução, mas aumentando a corrente e o aquecimento Joule. Solventes orgânicos como acetonitrila ou metanol podem ser adicionados ao BGE para alterar a solubilidade dos analitos, alterar a constante dielétrica e modificar o EOF. Separações quirais são alcançadas adicionando ciclodextrinas ou outros seletores quirais ao BGE, que formam complexos diastereoméricos transitórios com enantiômeros.
Pratos Teóricos e Resolução
As separações por CZE são caracterizadas por números de pratos extremamente altos, frequentemente excedendo 200.000 pratos por metro. O alargamento de zona na CZE é dominado pela difusão longitudinal, porque o perfil plano do EOF elimina o alargamento induzido pelo fluxo que limita a eficiência da HPLC. O número de pratos teóricos (N) é dado por N = (µ_app V) / (2 D), onde µ_app é a mobilidade aparente, V é a tensão aplicada e D é o coeficiente de difusão. A resolução entre dois picos depende da diferença em suas mobilidades aparentes, do número médio de pratos e da velocidade eletrosmótica. A resolução pode ser melhorada aumentando a tensão aplicada (até o limite do aquecimento Joule), estendendo o comprimento efetivo do capilar, reduzindo o EOF (diminuindo o pH ou usando capilares revestidos) ou otimizando a composição do tampão para maximizar a diferença de mobilidade entre os analitos.
Empilhamento de Amostra para Maior Sensibilidade
A sensibilidade de concentração da CZE com detecção por absorbância UV é limitada pelo curto comprimento do caminho óptico e pelo pequeno volume de injeção (tipicamente 1 a 20 nL). Técnicas de pré-concentração no capilar, conhecidas coletivamente como empilhamento (stacking), melhoram dramaticamente a sensibilidade ao concentrar a zona da amostra antes do início da separação. O empilhamento de amostra amplificado por campo (FASS) explora a diferença de condutividade entre a matriz da amostra (baixa condutividade) e o BGE (alta condutividade). Quando a tensão é aplicada, o campo elétrico mais alto na zona da amostra de baixa condutividade faz com que os íons do analito migrem rapidamente até atingirem o limite do BGE, onde desaceleram e se acumulam em uma banda estreita. O sweeping utiliza fases pseudoestacionárias como micelas para capturar e focar analitos neutros ou carregados. A isotacoforese transiente (tITP) emprega um sistema de eletrólito líder e terminador para focar os analitos em zonas nítidas, semelhante à isotacoforese capilar, antes de transicionar para a separação por CZE. Esses métodos de empilhamento podem fornecer um aumento de sensibilidade de 10 a 1000 vezes, trazendo os limites de detecção UV para a faixa nanomolar baixa.
Aplicações no Laboratório Clínico
A CZE é amplamente utilizada em laboratórios clínicos para análise de proteínas séricas, onde substituiu em grande parte a eletroforese em gel de agarose para a eletroforese de proteínas séricas (SPEP) de rotina. As proteínas séricas se separam em cinco frações principais — albumina, alfa-1, alfa-2, beta e gamaglobulinas — e o eletroferograma é avaliado para gamopatias monoclonais, padrões inflamatórios e deficiências proteicas. A CZE também é o método de escolha para triagem de hemoglobinopatias, separando variantes da hemoglobina como HbA, HbF, HbS e HbC em pH alcalino. Na análise farmacêutica, a CZE é usada para testes de pureza de medicamentos, determinação de contraíons e perfil de impurezas quirais. Na proteômica, a CZE acoplada à espectrometria de massas (CZE-MS/MS) fornece separação de peptídeos de alta eficiência para identificação de proteínas bottom-up, particularmente vantajosa para amostras de baixo volume e peptídeos básicos que são desafiadores para LC-MS em fase reversa.
Considerações sobre Desenvolvimento de Métodos
O desenvolvimento de um método CZE começa com a seleção do pH do BGE com base nos valores de pKa dos analitos. Um tampão fosfato ou borato em pH 2,5 é um ponto de partida comum para moléculas pequenas e peptídeos. As dimensões do capilar (comprimento, diâmetro interno) e a tensão aplicada são escolhidas para equilibrar a velocidade de análise com a resolução. A temperatura da coluna é controlada por resfriamento a ar forçado ou líquido para dissipar o calor Joule, e o capilar é enxaguado entre as corridas com hidróxido de sódio, água e BGE para manter a reprodutibilidade. Para análise quantitativa, um padrão interno é adicionado para corrigir a variabilidade do volume de injeção, e o método é validado quanto à linearidade, precisão, exatidão e robustez de acordo com as diretrizes do ICH.
