A cromatografia em coluna é o método de purificação mais amplamente utilizado em química orgânica. Separa compostos com base na sua partição diferencial entre uma fase móvel (solvente) e uma fase estacionária (adsorvente).

Fases Estacionárias

• Sílica gel (SiO₂): a fase estacionária mais comum. É polar e retém compostos polares mais fortemente. Os tamanhos de partícula variam de 40–63 µm para cromatografia flash a 15–40 µm para HPLC.
• Alumina (Al₂O₃): disponível nas formas básica, neutra e ácida. Menos comum que a sílica, mas útil para compostos sensíveis a bases e separações onde a sílica causa degradação.
• Sílica de fase reversa C18: sílica modificada com cadeias octadecil (C18), tornando-a não polar. Usada com fases móveis polares (água, metanol, acetonitrilo). A cromatografia de fase reversa é o padrão para separar compostos não polares a moderadamente polares.

Fase Móvel (Eluente)

O sistema de solventes é escolhido por cromatografia em camada fina (TLC). O objetivo é um Rf de 0,2–0,4 para o composto alvo. Comece com um solvente não polar (hexano, éter de petróleo) e adicione um modificador polar (acetato de etilo, metanol) em proporções crescentes. A eluição por gradiente — começando com baixa polaridade e aumentando gradualmente — fornece a melhor separação.

Cromatografia Flash

A cromatografia flash usa ar comprimido ou azoto para empurrar o solvente através da coluna a 1–10 bar, reduzindo o tempo de separação de horas para minutos. Os sistemas flash modernos (Biotage, Teledyne Isco) usam cartuchos pré-embalados com uma bomba de gradiente e um detetor UV integrado que recolhe automaticamente frações quando um pico é detetado.

Montagem manual de flash:

1. Empacote uma coluna de vidro com sílica — seja a seco (bater para assentar) ou em pasta (despejar uma suspensão sílica–solvente).
2. Aplique a amostra como uma solução concentrada ou adsorvida numa pequena quantidade de sílica (carga seca).
3. Adicione uma camada de areia no topo para proteger a superfície da sílica.
4. Aplique pressão de solvente e recolha frações em tubos.
5. Analise as frações por TLC. Combine as frações puras e evapore.

Recolha de Frações e Deteção

As frações são tipicamente de 5–20 mL dependendo do tamanho da coluna e da dificuldade de separação. A TLC é o método padrão para determinar quais frações contêm o composto desejado. Compostos ativos em UV podem ser detetados sob uma lâmpada UV de 254 nm. A coloração da placa de TLC com KMnO₄, p-anisaldeído ou molibdato de amónio cérico visualiza compostos não ativos em UV.

Fase Normal vs. Fase Reversa

A fase normal (sílica, fase móvel não polar) separa por polaridade — compostos não polares eluem primeiro. A fase reversa (C18, fase móvel polar) separa por hidrofobicidade — compostos polares eluem primeiro. A fase reversa é dominante em HPLC analítico, mas menos comum em purificação orgânica preparativa, onde a sílica de fase normal continua a ser o padrão.