Enquanto o CRISPR/Cas9 é usado para editar genes individuais, a triagem CRISPR escala a engenharia genômica para todo o genoma em um único experimento, identificando genes que conferem resistência, sensibilidade ou um fenótipo específico.
Princípio
Uma triagem CRISPR agrupada usa uma biblioteca de sequências de RNA guia único (sgRNA) visando cada gene do genoma (ou um subconjunto focado). Cada sgRNA direciona Cas9 para criar uma quebra de fita dupla em um locus genômico específico, produzindo um knockout. Ao rastrear quais sgRNAs são enriquecidos ou empobrecidos em uma população sob seleção, a triagem identifica genes funcionalmente relevantes.
Design da Biblioteca
Bibliotecas CRISPR genômicas (Brunello, TKOv3, GeCKO) contêm 4–6 sgRNAs por gene, mais 100–1000 controles não direcionados. Cada sgRNA é uma sequência de 20 nt visando um sítio adjacente a PAM no genoma. A biblioteca é sintetizada como um pool de oligonucleotídeos, clonada em um vetor lentiviral e empacotada em lentivírus.
Fluxo de Trabalho da Triagem
- Transdução: infectar células que expressam Cas9 com a biblioteca lentiviral de sgRNA em baixa multiplicidade de infecção (MOI ~0,3) para que a maioria das células receba um único sgRNA. Usar células suficientes para manter uma representação ~500× de cada sgRNA.
- Seleção: 48 horas após a transdução, adicionar puromicina (ou outro antibiótico de seleção) para selecionar células que integraram a biblioteca.
- Seleção fenotípica: após 7–14 dias de propagação, aplicar a condição experimental: tratamento medicamentoso, exposição a toxina, privação ou classificação de células com base em um repórter. Uma população de controle paralela é cultivada sem seleção.
- Sequenciamento: extrair DNA genômico de ambas as populações, amplificar por PCR a região codificadora de sgRNA e sequenciar em uma plataforma Illumina.
- Análise: alinhar as leituras à referência da biblioteca, contar sgRNAs por gene e calcular a mudança de dobra entre populações selecionadas e controle. Genes com sgRNAs significativamente empobrecidos são essenciais para a sobrevivência; sgRNAs enriquecidos indicam genes de resistência.
Considerações Chave
- Representação: manter pelo menos 500 células por sgRNA durante toda a triagem para evitar artefatos de queda.
- Expressão de Cas9: as células devem expressar Cas9 em altos níveis. Linhagens estáveis que expressam Cas9 ou linhagens com knock-in de Cas9 são preferidas.
- Controles: incluir um controle de toxicidade (por exemplo, uma dose alta do medicamento) para confirmar que o empobrecimento é específico, e um controle sem seleção para contabilizar os efeitos de crescimento dos próprios sgRNAs.
Aplicações
Triagens CRISPR têm sido usadas para identificar mecanismos de resistência a quimioterápicos, terapias alvo e imunoterapias; descobrir fatores do hospedeiro necessários para infecção viral; mapear interações letais sintéticas no câncer; e identificar genes que regulam diferenciação, migração e metabolismo celular.
Comparação com Triagens de shRNA
Triagens CRISPR criam knockouts completos (mutações de deslocamento de quadro) em vez de knockdowns (degradação de mRNA), proporcionando uma perda de função mais consistente e completa. Elas têm menos efeitos fora do alvo que shRNA devido à sequência alvo mais longa (20 nt vs. 19 nt) e ao requisito de uma sequência PAM. No entanto, as triagens CRISPR são limitadas a genes codificadores de proteínas, enquanto as triagens de shRNA podem alvejar RNAs não codificantes.
