A ligação e clonagem de DNA é um conjunto de técnicas usadas para unir fragmentos de DNA e inseri-los em um vetor – uma molécula transportadora de DNA – para replicação dentro de um organismo hospedeiro, normalmente uma bactéria. Isto permite aos cientistas produzir grandes quantidades de uma sequência específica de DNA.
Como funciona a ligação e clonagem de DNA
- Preparando a Inserção e o Vetor
Tanto o fragmento de DNA de interesse (a inserção) quanto o vetor (geralmente um plasmídeo) são cortados com as mesmas enzimas de restrição. Isso cria extremidades adesivas complementares – saliências curtas e de fita única que podem emparelhar-se entre si.
- Ligadura
A inserção cortada e o vetor são misturados com DNA ligase, uma enzima que sela a estrutura açúcar-fosfato do DNA. As extremidades adesivas complementares se alinham e a ligase forma ligações covalentes, unindo a inserção permanentemente ao vetor.
- Transformação
O plasmídeo ligado é introduzido em células bacterianas competentes através de um processo denominado transformação. Isto é muitas vezes conseguido por choque térmico ou eletroporação, o que torna a membrana bacteriana temporariamente permeável ao DNA.
- Seleção
As bactérias transformadas são plaqueadas em ágar contendo um antibiótico. O plasmídeo carrega um gene de resistência a antibióticos, de modo que apenas as bactérias que absorveram o plasmídeo sobrevivem. Isto cria colônias, cada uma descendente de uma única célula contendo o DNA clonado.
- Triagem
As colônias são examinadas por PCR de colônia ou digestão de restrição para confirmar que contêm a inserção correta. As colónias positivas são cultivadas em cultura líquida para produzir grandes quantidades do plasmídeo desejado.
Protocolo Prático de Ligadura
Calcule a proporção molar inserção:vetor ideal usando a fórmula: massa da inserção (ng) = (massa do vetor (ng) × tamanho da inserção (kb) / tamanho do vetor (kb)) × proporção desejada. Para clonagem padrão, use uma proporção molar de inserção:vetor de 3:1. Configure uma reação de ligação de 10 μL: 50 ng de vetor linearizado, a massa calculada de inserção, 1 μL de tampão ligase de DNA 10× T4 (contendo ATP), 1 μL de DNA ligase T4 (400 U/μL) e água para 10 μL. Inclui dois controles: uma ligação somente vetorial (sem inserção) para medir o fundo da autoligação e um controle sem ligase. Incubar a 16°C durante 1–2 horas ou a 4°C durante a noite para máxima eficiência. Para ligaduras de extremidade romba, use 1 μL de ligase e incubar a 16°C por 16 horas. Após a ligação, transforme 2–5 μL em 50 μL de células competentes de E. coli por choque térmico: incubar em gelo por 30 minutos, aquecer a 42°C por 45 segundos, retornar ao gelo por 2 minutos, adicionar 950 μL de meio SOC e incubar a 37°C por 1 hora com agitação. Placa 100 μL em LB-ágar com o antibiótico apropriado e, se estiver usando triagem azul-branca, adicione 40 μL de X-gal (20 mg/mL) e 40 μL de IPTG (100 mM). As colônias brancas indicam inserção bem-sucedida (gene lacZ interrompido), enquanto as colônias azuis contêm vetor autoligado. Uma boa ligação deve produzir 10–100× mais colônias do que o controle somente vetorial, com >70% de colônias brancas.
Aplicação no mundo real
Ao clonar um gene GFP de 0,8 kb em pUC19 (2,7 kb) com uma proporção molar de 3:1, a ligação produz ~200 colônias em placas de ampicilina-X-gal. Destes, 165 (82%) são brancos. Colônia PCR em 10 colônias brancas confirma a inserção GFP em todas as 10, demonstrando ligadura e triagem eficientes.
