A epigenómica estuda padrões de metilação do DNA, modificações de histonas e acessibilidade da cromatina em todo o genoma. Duas das técnicas epigenómicas mais amplamente usadas são o ATAC-seq e a sequenciação de bissulfito.
ATAC-Seq
O ATAC-seq (Ensaio para Cromatina Acessível por Transposase) mapeia regiões de cromatina aberta — DNA livre de nucleossomas onde os fatores de transcrição e outras proteínas reguladoras se ligam. Usa a transposase Tn5 hiperativa, que fragmenta simultaneamente o DNA e insere adaptadores de sequenciação em regiões de cromatina acessível.
O protocolo é notavelmente simples:
- Colete 50.000 células (frescas ou criopreservadas).
- Lise as membranas celulares para libertar os núcleos.
- Incube os núcleos com transposase Tn5 carregada com adaptadores de sequenciação durante 30 minutos a 37 °C.
- Purifique o DNA tagmentado, amplifique por PCR com primers de código de barras e sequencie paired-end numa plataforma Illumina.
As leituras são alinhadas ao genoma de referência, e picos de atividade da transposase indicam cromatina aberta. Estes picos estão enriquecidos em promotores, enhancers e outros elementos reguladores. O ATAC-seq também pode inferir o posicionamento de nucleossomas e as pegadas de ligação de fatores de transcrição a partir do padrão de comprimentos dos fragmentos.
As principais vantagens são a velocidade (a preparação da biblioteca leva 2–3 horas) e os baixos requisitos de entrada (até 500 células, e o ATAC-seq de célula única é agora rotineiro).
Sequenciação de Bissulfito
A sequenciação de bissulfito deteta 5-metilcitosina (5mC) no DNA. O tratamento com bissulfito de sódio converte citosinas não metiladas em uracilo (que é lido como timina após PCR), enquanto as citosinas metiladas permanecem inalteradas. A sequência resultante é comparada a uma referência para determinar o estado de metilação com resolução de base única.
A sequenciação de bissulfito do genoma completo (WGBS) fornece um mapa de metilação abrangente, mas é cara. A sequenciação de bissulfito de representação reduzida (RRBS) usa digestão com MspI para enriquecer regiões ricas em CpG, reduzindo o custo da sequenciação. A sequenciação de bissulfito direcionada amplifica regiões específicas de interesse, tais como ilhas CpG de promotores.
Considerações principais:
- O tratamento com bissulfito degrada o DNA. Comece com 100–500 ng de DNA de alta qualidade.
- A eficiência de conversão deve ser >99%. Controlos spike-in de DNA lambda não metilado permitem calcular a taxa de conversão.
- O alinhamento requer um alinhador consciente de bissulfito (Bismark, BSMAP ou BWA-meth) que mapeie as leituras para uma referência convertida por bissulfito.
- A metilação é relatada como valores β (0 a 1) ou valores M para cada sítio CpG.
Comunalidades na Análise de Dados
Tanto o ATAC-seq como a sequenciação de bissulfito produzem ficheiros FASTQ que são alinhados ao genoma de referência. Para ATAC-seq, a chamada de picos usa MACS2 ou Genrich; para dados de bissulfito, a chamada de metilação usa scripts dentro do pipeline Bismark. As métricas de qualidade incluem fração de leituras em picos (FRiP) para ATAC-seq e taxa de conversão de bissulfito para dados de metilação.
