Após a amplificação por PCR ou digestão por enzimas de restrição, o DNA deve ser purificado, removendo enzimas, primers, nucleótidos, sais e componentes do tampão antes das aplicações downstream. Dois métodos relacionados cobrem a maioria das necessidades de purificação.
Purificação de PCR
A purificação de PCR remove primers, dNTPs, polimerases e sais de uma reação de amplificação. A maioria dos kits comerciais usa uma membrana de sílica numa coluna de centrifugação: o DNA liga-se à membrana na presença de uma alta concentração de sais caotrópicos, os contaminantes passam, e o DNA é eluído num tampão de baixa salinidade (tipicamente Tris 10 mM ou água).
O protocolo típico: adicione tampão de ligação (contendo cloridrato de guanidina ou caotrópico semelhante) diretamente à reação de PCR, carregue na coluna, centrifugue, lave com tampão de lavagem à base de etanol, centrifugue novamente e elua em 20–50 µL. A recuperação é tipicamente de 60–90%.
A purificação de PCR é rápida (5–10 minutos) e funciona para fragmentos >100 pb. Não remove dímeros de primers ou produtos inespecíficos de tamanho semelhante — apenas primers em excesso e fragmentos pequenos que passam através da coluna.
Extração em Gel
A extração em Gel isola uma banda específica de DNA de um gel de agarose, removendo todos os outros fragmentos de DNA, incluindo dímeros de primers e produtos de priming incorreto. A banda desejada é excisada sob luz UV usando um bisturi limpo, e a agarose é dissolvida numa solução de sal caotrópico a 50–60 °C. A agarose fundida é então passada através de uma coluna de sílica como na purificação de PCR.
Considerações principais:
- Minimize o tempo de exposição aos UV para evitar danos ao DNA (use UV de 365 nm em vez de 302 nm se disponível).
- Corte o mais próximo possível da banda para minimizar o volume de agarose.
- A etapa de dissolução requer tampão suficiente — tipicamente 3 volumes por volume de gel.
- O rendimento diminui para fragmentos >10 kb; incubar o gel dissolvido à temperatura ambiente em vez de na coluna melhora a recuperação de fragmentos grandes.
Purificação de DNA por Precipitação
A precipitação com etanol é uma alternativa tradicional que não requer kits. Adicione 0,1 volumes de acetato de sódio 3 M (pH 5,2) e 2,5 volumes de etanol 100% frio, incube a −20 °C ou −80 °C, centrifugue à velocidade máxima durante 15–30 minutos, lave com etanol 70%, seque ao ar e ressuspenda. Este método funciona para qualquer tamanho de fragmento, mas demora mais tempo e não remove dNTPs tão eficientemente quanto as colunas de sílica.
Controlo de Qualidade
Após a purificação, meça a razão A₂₆₀/A₂₈₀ para verificar a pureza (idealmente 1,8–2,0). Corra uma alíquota num gel para verificar se a banda está intacta e com o tamanho correto. Para clonagem, o tampão de eluição deve ser compatível com as enzimas downstream — elua em água ou Tris 10 mM (não EDTA se houver ligação subsequente).
