O ensaio de pull-down com etiqueta GST utiliza proteínas de fusão com glutationa S-transferase (GST) imobilizadas em agarose-glutationa para purificar proteínas recombinantes de sistemas de expressão ou para capturar e identificar interações proteína-proteína de lisados celulares.
Princípio
A proteína GST de 26 kDa de Schistosoma japonicum é fundida à proteína alvo. A GST liga glutationa (GSH, γ-glutamil-cisteinil-glicina) imobilizada em esferas de agarose com alta afinidade (K_d ≈ 0,1 µM). A proteína de fusão é capturada de lisados brutos, lavada extensivamente e eluída com 10–20 mM de glutationa reduzida sob condições não desnaturantes. Para estudos de interação, a proteína de fusão GST imobilizada serve como isca para capturar proteínas interagentes de um lisado, que são então identificadas por Western blot ou espectrometria de massas.
Resinas de Glutationa
A agarose-glutationa é tipicamente esferas de agarose reticuladas com glutationa acoplada através do átomo de enxofre. A capacidade de ligação é de 5–15 mg de proteína de fusão GST por mL de resina. A glutationa reduzida é usada como eluente competitivo. A pré-hidratação e equilibração em PBS ou tampão similar (pH 7,3–8,0) é necessária antes do uso. Esferas magnéticas de glutationa permitem pull-downs rápidos em microtubos para estudos de interação em pequena escala.
Expressão e Lise
As proteínas de fusão GST são expressas em cepas de E. coli BL21(DE3) a partir de vetores pGEX (GE Healthcare), que incluem um promotor tac induzível com IPTG. Expressão a 18–25 °C durante a noite melhora a solubilidade de alvos difíceis. Lise em PBS (NaCl 140 mM, KCl 2,7 mM, Na₂HPO₄ 10 mM, KH₂PO₄ 1,8 mM, pH 7,3) com Triton X-100 a 1% ou Tween-20 a 0,1% reduz a ligação inespecífica. DTT (1–5 mM) mantém a GST em sua forma reduzida ativa. Inibidores de protease e DNase/RNase melhoram a qualidade do lisado.
Protocolo de Purificação
Equilibrar agarose-glutationa com PBS. Incubar o lisado clarificado com a resina (batelada: 30–60 min, 4 °C; coluna: fluxo por gravidade). Lavar com 20 volumes de PBS mais Triton X-100 a 0,1%. Eluir com 10 mM de glutationa reduzida em Tris-HCl 50 mM pH 8,0. Coletar frações de 0,5 mL. Dialisar a proteína eluída para remover a glutationa para aplicações a jusante. Remover a etiqueta GST por clivagem com trombina ou protease PreScission em um sítio de reconhecimento projetado, seguido por uma etapa subtrativa de agarose-glutationa para capturar GST livre e fusão não clivada.
Protocolo de Pull-Down para Interações
Imobilizar 50–200 µg de isca de fusão GST em 25–50 µL de agarose-glutationa. Incubar com lisado celular (0,5–2 mg de proteína total) em tampão de ligação (PBS + NP-40 a 0,1%) por 1–2 horas a 4 °C com rotação. Lavar 3–5 vezes com tampão de ligação. Eluir com tampão de amostra SDS 2× e analisar por SDS-PAGE seguido de coloração com Coomassie ou Western blot. Incluir esferas somente com GST como controle negativo para identificar proteínas que se ligam inespecificamente à GST ou à resina. A pré-incubação com glutationa competitiva (10 mM) demonstra competição específica.
Vantagens e Limitações
A etiqueta GST frequentemente aumenta a expressão e solubilidade de seu parceiro de fusão, tornando-a valiosa para proteínas difíceis. A eluição com glutationa é suave e preserva a atividade da proteína. No entanto, o grande tamanho (26 kDa) pode interferir em alguns ensaios funcionais, exigindo a remoção da etiqueta. A dimerização da GST pode causar oligomerização indesejada de proteínas de fusão. A etiqueta é ideal para estudos de interação de captura por afinidade, mas menos adequada se a adição de 26 kDa ao peso molecular for problemática para trabalhos estruturais.
