A cromatografia de afinidade por metal imobilizado purifica proteínas recombinantes com cauda de polihistidina ligando-se a íons metálicos de transição imobilizados (Ni²⁺ ou Co²⁺) através dos anéis imidazol das cadeias laterais da histidina e eluindo com imidazol ou pH baixo.
Princípio
Uma cauda de polihistidina — tipicamente 6 a 10 resíduos consecutivos de histidina — é fundida ao N- ou C-terminal da proteína recombinante. A cadeia lateral imidazol da histidina coordena com íons metálicos divalentes quelados (Ni²⁺, Co²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺) imobilizados em um suporte cromatográfico via queladores de ácido nitrilotriacético ou ácido iminodiacético. O Ni-NTA (ácido nitrilotriacético) fornece quatro sítios de coordenação para o íon Ni²⁺, deixando dois sítios disponíveis para ligação da histidina. A interação é reversível: o imidazol (20–500 mM) desloca competitivamente a cauda de histidina, ou o pH baixo (4,5–5,5) protona as cadeias laterais da histidina, interrompendo a coordenação do metal.
Tipos de Resina
Agarose Ni-NTA (Qiagen, Thermo Fisher) é a resina IMAC mais amplamente utilizada. A capacidade de ligação é tipicamente 5–10 mg de proteína com cauda 6×His por mL de resina sedimentada. Ni-Sepharose (GE Healthcare) oferece maiores taxas de fluxo para aplicações de FPLC. TALON (Clontech/TaKaRa) usa resina de Co²⁺-carboximetilaspartato, fornecendo maior especificidade com menor ligação inespecífica que o Ni-NTA, ao custo de menor capacidade. Esferas magnéticas (Dynabeads His-Tag, MagnaHis) permitem purificação em batelada a partir de pequenos volumes. Resinas de alta capacidade (até 40 mg/mL) estão disponíveis para purificação preparativa.
Tampões
Tampão de lise/carregamento: Tris ou fosfato 20–50 mM pH 7,5–8,0, NaCl 300–500 mM (suprime interações iônicas), imidazol 10–20 mM (reduz ligação inespecífica). Tampão de lavagem: mesma composição com imidazol 20–40 mM. Tampão de eluição: imidazol 200–500 mM ou gradiente de pH para 4,5. A concentração de NaCl é crítica — sal mais baixo aumenta a ligação inespecífica de proteínas ácidas. Aditivos como DTT 1 mM ou TCEP previnem oxidação de cisteínas de superfície. Para proteínas de membrana, detergentes compatíveis com IMAC (DDM, CHAPS, digitonina) a 0,1–1% podem ser incluídos.
Protocolo
Lisar células em tampão de lise com inibidores de protease. Clarificar por centrifugação (20.000 g, 30 min) e filtração (0,45 µm). Equilibrar a resina com 5 volumes de tampão de lise. Incubar o lisado clarificado com a resina (modo batelada: 30 min rotando a 4 °C, ou modo coluna: carregar a 0,5–1 mL/min). Lavar com 10–20 volumes de coluna de tampão de lavagem até a linha de base UV estabilizar. Eluir com 5–10 volumes de tampão de eluição, coletando frações. Analisar frações por SDS-PAGE e Western blot ou ensaio de Bradford.
Posicionamento e Remoção da Etiqueta
A etiqueta 6×His pode ser colocada em qualquer terminal. Etiquetas N-terminais são mais comuns e produzem maior expressão em E. coli, mas etiquetas C-terminais reduzem o risco de afetar sequências sinal N-terminais. A etiqueta pode ser removida incorporando um sítio de clivagem de protease TEV, trombina ou Fator Xa entre a etiqueta e a proteína. A clivagem é realizada após a eluição, seguida por uma etapa IMAC subtrativa para remover a etiqueta clivada e a proteína não clivada.
Aplicações
A purificação His-tag/IMAC é o método de purificação de proteínas mais amplamente utilizado em biologia molecular. Funciona para proteínas solúveis expressas em E. coli, levedura, células de inseto e células de mamífero. Também purifica proteínas de membrana solubilizadas em detergentes, proteínas de corpos de inclusão purificadas sob condições desnaturantes (ureia 8 M ou cloridrato de guanidina 6 M) e complexos proteicos via etiquetagem sequencial de parceiros de interação (co-IMAC). O pequeno tamanho da etiqueta raramente interfere na função da proteína, tornando-a ideal para captura por afinidade, estudos estruturais e ensaios enzimáticos.
