O sequenciamento de próxima geração (NGS) abrange um conjunto de tecnologias modernas de sequenciamento que podem sequenciar milhões de fragmentos de DNA em paralelo, tornando possível sequenciar genomas inteiros de forma rápida e acessível. Plataformas como Illumina, Ion Torrent e PacBio dominam o campo.
Como funciona o NGS (Plataforma Illumina)
- Preparação da Biblioteca
O DNA é fragmentado em pequenos pedaços, normalmente de 200 a 600 pares de bases. Adaptadores – sequências curtas conhecidas – são ligados a ambas as extremidades de cada fragmento. Esses adaptadores permitem que os fragmentos se liguem à célula de fluxo e sirvam como locais de preparação para sequenciamento.
- Geração de Clusters
A biblioteca é carregada numa célula de fluxo cuja superfície é revestida com oligonucleótidos complementares. Cada fragmento se liga à célula de fluxo e passa por uma amplificação de ponte: o fragmento se curva, uma nova fita é sintetizada e o processo se repete, criando um agrupamento de milhares de cópias idênticas de cada fragmento.
- Sequenciamento por Síntese
Nucleotídeos marcados fluorescentemente fluem pela célula de fluxo, um de cada vez. Cada nucleotídeo possui um terminador reversível que permite a adição de apenas uma base por ciclo. Após cada ciclo, a fluorescência é visualizada para identificar qual base foi adicionada a cada cluster.
- Análise de dados
Milhões de leituras de sequenciamento são geradas. Essas leituras são alinhadas a um genoma de referência ou montadas de novo. Ferramentas de bioinformática identificam variantes genéticas, níveis de expressão gênica ou modificações epigenéticas dependendo da aplicação.
- Aplicações
O NGS é usado para sequenciamento de genoma completo, painéis de genes direcionados, sequenciamento de RNA, análise epigenética e metagenômica, entre muitas outras aplicações.
Fluxo de trabalho prático de preparação da biblioteca NGS
Comece com 10–100 ng de DNA genômico de alta qualidade (A260/A280 > 1,8, A260/A230 > 2,0). Fragmente o DNA usando um sonicador Covaris ou fragmentação enzimática para atingir um tamanho alvo de 200-600 pb. Realize o reparo final para gerar extremidades rombas, seguido de cauda A (adição de uma única adenosina às extremidades 3’) usando o fragmento Klenow. Ligate adaptadores compatíveis com Illumina contendo uma saliência de 5’ T aos fragmentos de cauda A usando T4 DNA ligase. Purifique os produtos de ligação usando esferas AMPure XP em uma proporção de 0,8× esfera para amostra para remover adaptadores não ligados. Amplifique a biblioteca ligada ao adaptador por PCR por 8 a 12 ciclos usando primers complementares às sequências do adaptador; incluem códigos de barras exclusivos de índice duplo para multiplexação de amostras. Limpe o produto PCR com esferas AMPure XP na proporção de 0,8×. Avalie a qualidade e a quantidade da biblioteca usando um Bioanalyzer ou TapeStation (distribuição de tamanho esperado: 250–700 pb) e quantificação fluorométrica Qubit. Normalize as bibliotecas para 4 nM, agrupe equimolarmente e desnature com NaOH 0,2 N antes de carregar na célula de fluxo Illumina às 1,8 pM para sequenciamento de extremidade emparelhada de 2 × 150 pb. Monitore a densidade do cluster (alvo: 800–1.200 K/mm² para HiSeq 4000) e pontuações Q30 (>80% para execuções de alta qualidade). Desmultiplexe a saída usando bcl2fastq e avalie a qualidade por base com FastQC. Corte adaptadores e bases de baixa qualidade usando Trimmomatic antes do alinhamento.
Aplicação no mundo real
Na genômica clínica do câncer, um painel NGS direcionado cobrindo 500 genes relacionados ao câncer é usado para traçar o perfil da biópsia tumoral de um paciente. A preparação da biblioteca a partir de 50 ng de DNA FFPE produz 94% dos alvos cobertos em >100× profundidade. A análise identifica uma mutação KRAS G12C (0,46 VAF) e uma amplificação de EGFR, orientando a seleção do tratamento com um inibidor MEK.
