A titulação viral é essencial para quantificar vírus infeciosos na investigação, produção de vacinas e diagnóstico clínico. O ensaio de placas é o padrão ouro para medir o título viral infecioso.
Princípio do Ensaio de Placas
Quando um vírus infeta uma monocamada de células suscetíveis numa placa de cultura, replica-se e espalha-se para as células adjacentes. Após várias rondas de infeção, uma zona localizada de morte celular (uma placa) torna-se visível. Assume-se que cada placa se origina de uma única partícula viral infeciosa.
O processo:
- Cultive uma monocamada confluente de células suscetíveis (ex.: células Vero para muitos vírus) numa placa de múltiplos poços.
- Infete a monocamada com diluições seriadas da amostra viral.
- Permita a adsorção viral por 1–2 horas com agitação periódica.
- Cubra as células com um meio semissólido (agarose, metilcelulose ou carboximetilcelulose) que impede o vírus de se espalhar através do meio líquido, limitando a infeção às células adjacentes ao local de infeção original.
- Incube por 2–10 dias (dependendo do vírus) até as placas ficarem visíveis.
- Fixe e cora a monocamada com violeta cristal, vermelho neutro ou formalina. As placas aparecem como áreas claras contra um fundo de células coradas.
Conte as placas e calcule: unidades formadoras de placas por mL (UFP/mL) = (número de placas) / (diluição × volume plaqueado em mL).
Ensaio TCID₅₀
O ensaio TCID₅₀ (Dose Infeciosa em Cultura de Tecido 50%) é um método de diluição de ponto final que não requer visualização de placas. Diluições seriadas do vírus são adicionadas a poços replicados de uma placa de 96 poços contendo células suscetíveis. Após incubação, os poços são avaliados quanto ao efeito citopático (CPE). O TCID₅₀ é a diluição na qual 50% dos poços apresentam CPE, calculado pelo método de Reed–Muench ou Spearman–Kärber.
Os valores de TCID₅₀/mL podem ser convertidos em UFP/mL (aproximadamente 1 UFP ≈ 0,7 unidades TCID₅₀), mas a relação não é exata e depende do vírus e do tipo celular.
Ensaio de Focos Fluorescentes
Para vírus que não produzem placas ou CPE claros, as proteínas virais são detetadas por imunofluorescência. A monocamada infetada é fixada e corada com anticorpos fluorescentes contra um antigénio viral. Os focos fluorescentes são contados ao microscópio de epifluorescência, dando unidades formadoras de focos por mL (UFF/mL).
Ensaio de Hemaglutinação
Alguns vírus (influenza, paramixovírus) têm proteínas hemaglutininas que se ligam e aglutinam glóbulos vermelhos. Diluições seriadas do vírus são misturadas com hemácias numa placa de fundo em V. O título de hemaglutinação é a diluição mais alta que ainda causa aglutinação (uma rede difusa de hemácias que não se sedimenta num botão). O ensaio HA é rápido e barato, mas mede partículas virais totais, não as infeciosas.
