Visão geral
A identificação de proteínas por espectrometria de massa é a pedra angular da proteômica. O fluxo de trabalho fundamental envolve digerir proteínas em peptídeos usando uma protease como a tripsina, medir as massas dos peptídeos intactos (MS1) e, em seguida, fragmentar peptídeos selecionados para gerar espectros de massa em tandem (MS/MS) que revelam sua sequência de aminoácidos. Os espectros resultantes são comparados com espectros teóricos derivados de bancos de dados de sequências de proteínas para atribuir identidades. Essa abordagem bottom-up ou shotgun é altamente escalável e pode identificar milhares de proteínas de misturas complexas em um único experimento.
Métodos
Impressão digital de massa de peptídeos (PMF) identifica proteínas comparando a lista de massas de peptídeos medidas experimentalmente com as massas de peptídeos teóricas calculadas a partir de um banco de dados. O PMF funciona melhor para misturas simples de proteínas ou proteínas purificadas separadas por técnicas como SDS-PAGE. Identificação MS em tandem (MS/MS) fragmenta peptídeos individuais para produzir espectros informativos de sequência. Os mecanismos de pesquisa comparam as séries de íons de fragmentos observados - principalmente íons b e y - com as séries previstas de peptídeos candidatos. Sequenciamento de novo infere a sequência peptídica diretamente do espectro quando nenhuma correspondência no banco de dados é encontrada, usando as diferenças de massa entre íons de fragmentos consecutivos para derivar a sequência.
Protocolo Prático
Um fluxo de trabalho típico de identificação de proteínas começa com uma mistura de proteínas - como um complexo imunoprecipitado, uma banda de gel SDS-PAGE ou uma fração [eletroforese em gel capilar](/guides/eletroforese em gel capilar). As proteínas são reduzidas com ditiotreitol 10 mM (DTT) a 56°C durante 30 minutos, alquiladas com iodoacetamida 55 mM no escuro durante 30 minutos e digeridas durante a noite com tripsina numa proporção enzima-substrato de 1:50 a 37°C. Os peptídeos resultantes são dessalinizados usando C18 ZipTips e carregados em um sistema nanoLC acoplado a um espectrômetro de massa Orbitrap. O instrumento opera no modo de aquisição dependente de dados: uma varredura MS1 completa de 350–1.600 m/z com resolução de 70.000 identifica os 15 íons precursores mais intensos, que são sequencialmente isolados e fragmentados por dissociação colisional de alta energia (HCD) a 27% de energia de colisão normalizada para produzir espectros MS/MS. Os espectros de fragmentos são pesquisados em um banco de dados de proteínas usando Mascot ou SEQUEST. Cada correspondência de espectro de peptídeo é pontuada com base na correlação entre íons de fragmentos experimentais e séries teóricas de íons b e y. Uma pesquisa de alvo-isca estima o FDR, e as correspondências são filtradas a 1% de FDR nos níveis de peptídeo e proteína. O agrupamento de proteínas colapsa peptídeos que mapeiam múltiplas proteínas de acordo com a parcimônia. Um exemplo de aplicação no mundo real: a identificação da composição do complexo de poros nucleares humanos por meio de fracionamento bioquímico e espectrometria de massa revelou mais de 30 nucleoporinas, muitas delas anteriormente não caracterizadas, fornecendo um quadro molecular abrangente do transporte nuclear. Outra aplicação é a identificação bacteriana por MALDI-TOF MS em microbiologia clínica, onde os perfis de proteínas ribossômicas servem como impressões digitais taxonômicas para identificação em nível de espécie em minutos, em vez de dias.
Aplicativos
A identificação de proteínas é aplicada em toda a biologia molecular e pesquisa clínica. Ele confirma a identidade de proteínas purificadas obtidas por meio de extração e purificação de proteínas, caracteriza componentes de experimentos de proteômica e espectrometria de massa e identifica complexos proteicos co-purificados com uma proteína de isca. Em microbiologia, é usado para identificar espécies bacterianas por meio de proteotipagem baseada em espectrometria de massa, complementando abordagens genômicas.
