A digestão com enzimas de restrição é uma técnica usada para cortar DNA em locais específicos e predeterminados. As enzimas de restrição - também chamadas de endonucleases de restrição - são tesouras moleculares que reconhecem sequências curtas e palindrômicas de DNA e clivam o DNA nesses locais ou próximo a eles.

Como funciona a digestão por enzimas de restrição

1. Escolhendo a Enzima

Cada enzima de restrição reconhece uma sequência específica de DNA, normalmente com 4 a 8 pares de bases. Exemplos comuns incluem EcoRI (GAATTC) e HindIII (AAGCTT). Os cientistas escolhem as enzimas com base no local onde elas cortam em relação à região de interesse do DNA.

2. Configurando a reação

O DNA purificado é misturado com a enzima de restrição, um tampão específico para essa enzima e água. O tampão fornece a concentração de sal e pH ideais para o funcionamento da enzima. A mistura é incubada na temperatura ideal da enzima, geralmente 37°C.

3. Incubação

Durante a incubação, a enzima examina o DNA em busca de sua sequência de reconhecimento. Ao encontrar uma correspondência, ele corta a espinha dorsal do DNA em locais precisos. Se o DNA contiver múltiplos locais de reconhecimento, ele será cortado em múltiplos fragmentos de tamanhos variados.

4. Inativação por Calor

Após tempo de incubação suficiente, a reação é frequentemente aquecida a 65–80°C para desnaturar e inativar a enzima, interrompendo a digestão. Os fragmentos de DNA resultantes podem então ser analisados por eletroforese em gel de agarose ou usados em aplicações posteriores, como clonagem.

Protocolo prático de resumo de restrição

Configure uma reação de 20–50 μL em um tubo de microcentrífuga. Para uma digestão única, combine 1 μg de DNA, 2 μL de tampão de restrição 10× (selecione o buffer recomendado pelo fabricante), 10 U de enzima de restrição (normalmente 1 μL) e água livre de nuclease até o volume final. Misture suavemente pipetando e incube na temperatura ideal da enzima (geralmente 37°C) por 1 hora. Para digestões duplas, use um tampão compatível com ambas as enzimas – a maioria dos fabricantes fornece uma tabela de compatibilidade. Se nenhum tampão fornecer >75% de atividade para ambas as enzimas, realize digestões sequenciais: primeiro com a enzima que requer menos sal, limpe o DNA e depois faça a digestão com a segunda enzima. Sempre inclua uma reação de controle sem enzima para confirmar que o DNA não está degradado. Após a incubação, inative o calor a 65–80°C durante 20 minutos (se a enzima for lábil ao calor) ou purifique o ADN digerido utilizando um kit de limpeza de coluna. Analise 5–10 μL por eletroforese em gel de agarose. Solucione problemas de digestão incompleta estendendo o tempo de incubação para 2–4 horas, adicionando enzima fresca após 1 hora ou usando 2–5 U por µg de DNA. Se o DNA for um plasmídeo superenrolado, pode levar de 2 a 3 horas para a linearização completa. Para DNA genômico, use 2–5 U por μg e incube durante a noite.

Aplicação no mundo real

Na clonagem de um gene humano (2 kb) em pUC19, tanto o produto de PCR como o vector são digeridos com EcoRI e HindIII. Um resumo duplo no buffer CutSmart produz pontas adesivas compatíveis. Após 1 hora a 37°C, a purificação em gel isola o vetor linearizado (2,7 kb) e a inserção (2 kb). A ligação e transformação em E. coli produz colónias, 80% das quais contêm a inserção correcta por PCR de colónia.