A interferência de RNA (RNAi) é um mecanismo natural no qual pequenas moléculas de RNA silenciam a expressão genética ao direcionar mRNA complementar para degradação ou repressão traducional. É uma das ferramentas mais poderosas para a genómica funcional.
Mecanismo
A via do RNAi começa com RNA de cadeia dupla (dsRNA) que é clivado pela enzima Dicer em small interfering RNAs (siRNAs) de 21–23 nucleótidos. Estes siRNAs são carregados no complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC), onde a cadeia guia é retida e a cadeia passageira é descartada. A cadeia guia emparelha-se com mRNA complementar, e a Argonaute-2 (Ago2), o componente catalítico do RISC, cliva o mRNA, impedindo a tradução.
Os microRNAs (miRNAs) endógenos seguem uma via semelhante, mas originam-se de precursores em forma de hairpin (pri-miRNA → pre-miRNA → miRNA maduro). A maioria dos miRNAs liga-se com complementaridade imperfeita à região 3′ UTR de mRNAs alvo, causando repressão traducional em vez de clivagem.
Ferramentas Experimentais de RNAi
- siRNA sintético: duplexos de dsRNA de 21 pb com extremidades protuberantes de 2 nt. Transfetados diretamente para as células. Eficaz por 3–7 dias. A abordagem mais comum para knockdown transitório.
- shRNA (short hairpin RNA): expresso a partir de um plasmídeo ou vetor viral. A estrutura em forma de hairpin é processada por Dicer em siRNA. O shRNA pode ser integrado estavelmente usando vetores lentivirais, permitindo knockdown a longo prazo e a criação de linhas celulares estáveis.
- Mímicos e inibidores de miRNA: RNAs sintéticos que imitam miRNAs endógenos (mímicos) ou os bloqueiam (antagomirs, sondas LNA). Usados para estudar a função de miRNAs específicos.
Considerações de Desenho
O desenho eficaz de siRNA requer:
- Direcionar a região codificante ou 3′ UTR do gene
- Evitar correspondências fora do alvo (verificar com BLAST)
- Conteúdo GC entre 35–55%
- Evitar repetições internas e estrutura secundária
Múltiplos siRNAs por alvo são recomendados. Inclua um controlo de siRNA não direcionado (scrambled) para distinguir efeitos específicos de inespecíficos. Um controlo positivo (ex.: siRNA contra um gene housekeeping) confirma que a transfecção e a maquinaria de RNAi estão a funcionar.
Limitações
- Efeitos fora do alvo: siRNAs podem silenciar genes não intencionais através de complementaridade parcial, particularmente na região seed (posições 2–8).
- Resposta ao interferão: dsRNA longo (>30 pb) desencadeia uma resposta imune inata. Use siRNAs sintéticos purificados para evitar isto.
- Durabilidade: o siRNA é diluído pela divisão celular. Para experiências de longa duração, use shRNA ou múltiplas transfecções.
- Knockdown incompleto: a proteína residual pode ainda ser funcional. Confirme o knockdown tanto a nível de mRNA (qPCR) como de proteína (Western blot).
