Visão geral
O sequenciamento de RNA pequeno tem como alvo a classe de moléculas curtas de RNA não codificantes - normalmente com 18 a 35 nucleotídeos de comprimento - que desempenham papéis regulatórios críticos na expressão gênica. Estes incluem microRNAs (miRNAs), pequenos RNAs interferentes (siRNAs) e RNAs que interagem com Piwi (piRNAs). Apesar de seu pequeno tamanho, essas moléculas exercem um controle poderoso sobre a estabilidade do mRNA, a tradução, o estado da cromatina e o silenciamento do transposon. O RNA-seq pequeno requer preparação de biblioteca especializada para capturar fragmentos tão curtos e ferramentas de bioinformática distintas para anotação e quantificação precisas.
Métodos
A preparação de uma pequena biblioteca de RNA-seq envolve a seleção do tamanho do RNA (normalmente por excisão em gel ou purificação baseada em esferas), ligação de adaptadores 3’ e 5’, transcrição reversa e amplificação por PCR. Como os RNAs pequenos são mais curtos que o comprimento de leitura, eles são sequenciados inteiramente e as sequências adaptadoras devem ser cortadas com precisão durante o pré-processamento. Ferramentas de alinhamento dedicadas (como miRDeep2, sRNAbench ou ShortStack) mapeiam leituras para pequenos bancos de dados de RNA conhecidos (miRBase para miRNAs, Rfam para outros ncRNAs). A quantificação estima os níveis de expressão de miRNAs conhecidos, enquanto a detecção de novos miRNAs depende de estruturas precursoras características em gancho. A análise de expressão diferencial segue princípios semelhantes ao mRNA-seq, mas com considerações especiais para normalização porque pequenos RNAs têm diferentes distribuições de comprimento e vieses de GC.
Aplicativos
O perfil de RNA pequeno revelou os papéis regulatórios abrangentes dessas moléculas. Assinaturas de miRNA distinguem subtipos de câncer e predizem a resposta ao tratamento. Os miRNAs circulantes no sangue ou soro servem como biomarcadores minimamente invasivos para doenças incluindo câncer, doenças cardiovasculares e neurodegeneração. A análise se conecta a estudos mais amplos de estrutura e tipos de RNA e de regulação genética e epigenética, já que muitos RNAs pequenos participam de alças regulatórias com fatores de transcrição e modificadores epigenéticos. A compreensão da biogênese de pequenos RNAs também se baseia em conceitos de transcrição e processamento de RNA, particularmente o papel de Drosha e Dicer na maturação de miRNA.
Protocolo Prático
A preparação da pequena biblioteca de RNA-seq começa com a entrada total de RNA (100–1000 ng). A seleção do tamanho é crítica: fragmentos de RNA de 18 a 35 nt são isolados por excisão em gel de um gel de poliacrilamida a 15% ou por purificação baseada em esferas com esferas AMPure XP em concentrações específicas de PEG. A ligação do adaptador usa T4 RNA ligase 2 truncada para o adaptador 3’ (minimizando a circularização) e T4 RNA ligase 1 para o adaptador 5’. Após a transcrição reversa com SuperScript III, o cDNA é amplificado por PCR (12 a 15 ciclos para evitar amplificação excessiva) e selecionado novamente por tamanho para remover dímeros adaptadores. Para pré-processamento, Cutadapt corta as sequências do adaptador com precisão: cutadapt -a TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG --discard-untrimmed -m 18 -M 35 -o trimmed.fastq raw.fastq. O sinalizador --discard-untrimmed remove leituras sem adaptador detectável. Para descoberta e quantificação de miRNA, miRDeep2 fornece um pipeline abrangente: execute mapper.pl para processar leituras, miRDeep2.pl para identificar miRNAs novos e conhecidos contra miRBase e quantifier.pl para quantificar a expressão. O pipeline pontua os precursores de miRNA candidatos avaliando a estrutura em gancho característica: uma pontuação miRDeep2 acima de 10 indica previsões de alta confiança. Ferramentas alternativas incluem sRNAbench para espécies com anotações miRBase incompletas e ShortStack para descoberta de novo de pequeno RNA sem um genoma de referência. A normalização de pequenos dados de expressão de RNA requer atenção especial; as opções incluem TPM (transcrições por milhão), leituras por milhão (RPM) ou o uso de controles de pico, como o cel-miR-39 sintético. A análise de expressão diferencial pode ser realizada com DESeq2 nos dados de contagem, mas a estimativa do fator de tamanho deve usar apenas contagens de miRNA em vez de leituras mapeadas totais para evitar viés de pequenos RNAs não-miRNA abundantes.
