Visão Geral

O sequenciamento de pequenos RNAs visa a classe de moléculas curtas de RNA não codificante — tipicamente com 18–35 nucleotídeos de comprimento — que desempenham papéis reguladores críticos na expressão gênica. Estes incluem microRNAs (miRNAs), pequenos RNAs interferentes (siRNAs) e RNAs interagindo com Piwi (piRNAs). Apesar de seu tamanho reduzido, essas moléculas exercem controle poderoso sobre a estabilidade do mRNA, tradução, estado da cromatina e silenciamento de transposons. O sequenciamento de pequenos RNAs requer preparação de biblioteca especializada para capturar fragmentos tão curtos e ferramentas bioinformáticas distintas para anotação e quantificação precisas.

Métodos

A preparação da biblioteca para pequenos RNAs envolve seleção por tamanho do RNA (tipicamente por excisão de gel ou purificação baseada em beads), ligação de adaptadores 3’ e 5’, transcrição reversa e amplificação por PCR. Como os pequenos RNAs são mais curtos que o comprimento de leitura, eles são sequenciados inteiramente, e as sequências de adaptadores devem ser removidas precisamente durante o pré-processamento. Ferramentas de alinhamento dedicadas (como miRDeep2, sRNAbench ou ShortStack) mapeiam leituras para bancos de dados conhecidos de pequenos RNAs (miRBase para miRNAs, Rfam para outros ncRNAs). A quantificação estima os níveis de expressão de miRNAs conhecidos, enquanto a detecção de novos miRNAs depende de estruturas precursoras características em forma de hairpin. A análise de expressão diferencial segue princípios semelhantes ao mRNA-seq, mas com considerações especiais para normalização, pois os pequenos RNAs têm diferentes distribuições de comprimento e vieses de GC.

Aplicações

O perfil de pequenos RNAs revelou os papéis reguladores generalizados dessas moléculas. Assinaturas de miRNA distinguem subtipos de câncer e predizem resposta ao tratamento. miRNAs circulantes no sangue ou soro servem como biomarcadores minimamente invasivos para doenças incluindo câncer, doença cardiovascular e neurodegeneração. A análise conecta-se a estudos mais amplos de estrutura e tipos de RNA e regulação gênica e epigenética, já que muitos pequenos RNAs participam de loops reguladores com fatores de transcrição e modificadores epigenéticos. A compreensão da biogênese de pequenos RNAs também se baseia em conceitos de transcrição e processamento de RNA, particularmente o papel de Drosha e Dicer na maturação de miRNAs.