Co-Immunpräzipitation (Co-IP) ist die am weitesten verbreitete Methode zum Nachweis und zur Identifizierung von Protein-Protein-Interaktionen unter nativen Bedingungen. Sie verwendet einen spezifischen Antikörper, um ein Zielprotein (Bait) und alle daran gebundenen Proteine aus einem Zelllysat zu fangen.

Prinzip

Ein Antikörper gegen das Zielprotein (Bait) wird auf einem festen Träger immobilisiert — typischerweise Protein A/G-Agarose-Kügelchen oder magnetische Kügelchen. Wenn die antikörperkonjugierten Kügelchen mit einem Zell- oder Gewebelysat inkubiert werden, wird das Zielprotein zusammen mit allen Proteinen, die physikalisch mit ihm assoziiert sind, eingefangen. Nach dem Waschen zur Entfernung ungebundenen Materials werden die gebundenen Proteine eluiert und mittels Western Blot oder Massenspektrometrie analysiert.

Protokollübersicht

1. Bereiten Sie das Lysat mit einem milden, nicht-denaturierenden Lysepuffer vor, der Proteininteraktionen bewahrt (z. B. 50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% NP-40, Proteaseinhibitoren). Halten Sie die Proben auf Eis.
2. Klären Sie das Lysat vor, indem Sie es mit leeren Kügelchen (ohne Antikörper) inkubieren, um Proteine zu entfernen, die unspezifisch an die Kügelchenoberfläche binden.
3. Inkubieren Sie das vorgeklärte Lysat mit den antikörperkonjugierten Kügelchen bei 4 °C für 1–4 Stunden (oder über Nacht) unter sanfter Rotation.
4. Waschen Sie die Kügelchen 3–5 Mal mit kaltem Lysepuffer. Die Stringenz kann durch Erhöhung der Salzkonzentration (250–500 mM NaCl) oder Zugabe eines milden Detergens (0,1% Tween-20) erhöht werden.
5. Eluieren Sie gebundene Proteine mit SDS-PAGE-Probenpuffer und Hitze (5 Minuten bei 95 °C).
6. Analysieren Sie mittels Western Blot (für bekannte Interaktoren) oder Massenspektrometrie (für Entdeckung).

Kontrollen

Strenge Kontrollen sind unerlässlich:

• Isotypkontrolle: verwenden Sie einen unspezifischen Antikörper desselben Isotyps, um spezifische Bindung vom Hintergrund zu unterscheiden.
• Kügelchen-Kontrolle: Kügelchen ohne Antikörper zur Identifizierung von Proteinen, die an die Kügelchenmatrix binden.
• Knockdown/Knockout-Kontrolle: Lysat von Zellen ohne das Zielprotein zeigt die Antikörperspezifität an.
• Reverse Co-IP: führen Sie die reziproke IP unter Verwendung eines Antikörpers gegen den vermuteten Interaktor durch.

Quervernetzung

Antikörper selbst eluieren mit dem Ziel mit und können die Massenspektrometrie beeinträchtigen. Die Quervernetzung des Antikörpers mit den Kügelchen (unter Verwendung von DSS oder BS³) vor der Inkubation verhindert die Antikörperelution. Eine Kontrolle mit quervernetzten Kügelchen muss bestätigen, dass der Antikörper nach der Quervernetzung noch funktionell ist.

Varianten

• Native Co-IP: verwendet nicht-denaturierenden Lysepuffer. Bewahrt native Komplexe, kann aber indirekt assoziierte Proteine co-präzipitieren.
• Crosslinking-Co-IP: ein reversibler Quervernetzer (z. B. Formaldehyd, DSP) stabilisiert schwache oder transiente Interaktionen vor der Lyse.
• Nukleäre Co-IP: für Transkriptionsfaktorkomplexe verwenden Sie ein nukleäres Extraktionsprotokoll und fügen Sie DNase I hinzu, um Chromatin-gebundene Proteine freizusetzen.