Knochen, Zähne und verkalktes Gewebe können ohne vorherige Entfernung der Kalziumsalze nicht mit einem Mikrotom geschnitten werden. Durch die Entkalkung (Entkalkung) wird das Gewebe durch die Extraktion von Kalziumionen weicher, so dass die organische Matrix für die Verarbeitung und das Schneiden intakt bleibt. Die Wahl der Entkalkungsmethode hängt davon ab, wie dringend Ergebnisse benötigt werden und welche nachgelagerten Tests geplant sind.
Warum entkalken?
Calciumhydroxylapatitkristalle (Ca10(PO4)6(OH)2) im Knochen und pathologische Verkalkungen machen das Gewebe zu hart für Mikrotomschnitte. Selbst dünne Knochenproben (z. B. entkalkte Knochenmark-Trepan-Biopsien) zerbrechen die Mikrotomklinge oder erzeugen unbrauchbare Schnitte, wenn sie nicht entkalkt werden. Eine Entkalkung ist für sämtliches mineralisiertes Gewebe erforderlich, einschließlich Knochen, Zähne, verkalkte Herzklappen, atherosklerotische Arterien und Tumorverkalkungen.
Säureentkalkung
Starke Säuren (Salpetersäure, 5–10 %, Ameisensäure, 10–20 %) entkalken schnell – kleine Knochenfragmente in 2–6 Stunden, kortikaler Knochen in 24–48 Stunden. Salpetersäure ist am schnellsten, kann jedoch Nukleinsäuren hydrolysieren und Proteine abbauen, was die IHC und molekulare Tests beeinträchtigt. Ameisensäure ist schonender und wird bevorzugt, wenn IHC oder PCR geplant sind.
Säure-Entkalkungsmechanismus – Protonen (H+) verdrängen Kalziumionen aus Hydroxylapatit und bilden lösliche Kalziumsalze, die aus dem Gewebe diffundieren. Die Reaktionsgeschwindigkeit hängt von der Säurekonzentration, der Temperatur (eine steigende Temperatur beschleunigt die Reaktion, erhöht aber die Gewebeschädigung) und der Bewegung ab. Der Endpunkt wird durch chemische Prüfung der Entkalkungsflüssigkeit auf Kalzium (Oxalat- oder Kalziumteststreifen) oder durch physikalische Beurteilung (das Gewebe biegt sich ohne Widerstand) bestimmt.
Chelatbildner (EDTA, Ethylendiamintetraessigsäure, 10–14 %, pH 7,0–7,4) entkalken, indem sie Calciumionen in einem stabilen Chelatkomplex binden. EDTA ist viel langsamer als Säuren – die Entkalkung dauert je nach Gewebegröße und -dichte 2–14 Tage – bewahrt aber Morphologie, Antigenität und Nukleinsäuren besser als jede Säuremethode. EDTA ist die bevorzugte Entkalkungsmethode, wenn IHC, FISH oder PCR folgen. Die EDTA-Entkalkung bei 4 °C ist noch langsamer (3–4 Wochen), sorgt aber für eine optimale Nukleinsäurekonservierung.
Entkalkungsprotokolle
Knochenmark-Trepan-Biopsien – 2–4 Stunden in Formalin fixiert, 2–4 Stunden (kleine Kerne) bis 24 Stunden (große Kerne) in EDTA oder Ameisensäure entkalkt. Eine übermäßige Entkalkung zerstört die Zelldetails des Knochenmarks und beeinträchtigt die IHC für Lymphoid- und Plasmazellmarker.
Femurköpfe und große Knochenproben – 24–48 Stunden in Formalin fixiert, mit einer Bandsäge in 3–5 mm dicke Scheiben geschnitten, 2–7 Tage in Ameisensäure-Natriumcitrat-Lösung oder EDTA entkalkt. Entkalkungslösung täglich wechseln. Testendpunkt mit Ammoniumoxalat – die Bildung eines Niederschlags weist darauf hin, dass immer noch Kalzium freigesetzt wird.
Verkalkte Weichteiltumoren – entkalken in EDTA, um die IHC-Antigenität zu bewahren. Säureentkalkung kann für die Tumorklassifizierung wesentliche Marker maskieren.
Endpunkterkennung
Chemische Tests – 1 ml Entkalkungsflüssigkeit zu 5 ml Ammoniumoxalatlösung hinzufügen; Ein weißer Niederschlag (Kalziumoxalat) innerhalb von 30 Sekunden weist darauf hin, dass die Entkalkung unvollständig ist. Röntgen – Proben können geröntgt werden, um Restverkalkungen festzustellen. Physikalisch – eine gebogene Sicherheitsnadel oder Skalpellklinge sollte ohne Widerstand durch das Gewebe dringen; Das Gewebe sollte sich wie fester Käse anfühlen, nicht wie Knochen.
Artefakte und Probleme
Überentkalkung – das häufigste Problem. Übermäßige Säureexposition zerstört die nukleare Basophilie (H&E zeigt blasse, geisterhafte Kerne), fragmentiert die DNA (PCR-Fehler) und denaturiert Proteine (IHC falsch negative Ergebnisse). Eine übermäßige Entkalkung mit EDTA ist weniger schädlich, sollte aber dennoch vermieden werden. Untere Entkalkung – Abschnitte enthalten harte, kiesige Bereiche, die den Abschnitt reißen oder die Klinge beschädigen; Legen Sie den Block für weitere Zeit in die Entkalkungslösung. Saures Hämatinpigment – braunschwarze doppelbrechende Kristalle aus Säurewechselwirkung mit formalinfixiertem Hämoglobin; durch Behandlung mit gesättigter alkoholischer Pikrinsäure entfernt.
Qualitätskontrolle
Dokumentieren Sie Entkalkungsmethode, Zeit, Temperatur und Endpunkt. Beurteilen Sie die Kernkonservierung bei H&E – gut entkalktes Gewebe zeigt scharfe Kerndetails, die mit nicht entkalktem Gewebe vergleichbar sind. IHC-Kontrollen müssen entkalktes Gewebe umfassen, um die Antigenkonservierung zu überprüfen. Positivkontrollen für IHC sollten mit der gleichen Methode wie das Testgewebe entkalkt werden. Die Teilnahme an EQA-Programmen für Knochenmark und Knochenpathologie umfasst die Beurteilung der Entkalkungsqualität.
