Unter Proteinquantifizierung versteht man den Prozess der Bestimmung der Proteinkonzentration in einer Lösung. Eine genaue Proteinquantifizierung ist für viele nachgelagerte Anwendungen unerlässlich, darunter SDS-PAGE, Western Blot, Enzymtests und Strukturstudien.
Gängige Methoden zur Proteinquantifizierung
Bradford-Assay
Der Bradford-Assay basiert auf der Bindung des Farbstoffs Coomassie Brilliant Blue G-250 an Proteine. Der Farbstoff verschiebt sich von Braun nach Blau, wenn er an Protein gebunden ist, wobei sich das Absorptionsmaximum von 465 nm auf 595 nm ändert. Der Assay ist schnell, einfach und mit den meisten Puffern kompatibel. Bei Anwesenheit von Reinigungsmitteln ist die Genauigkeit geringer.
BCA-Assay
Der Bicinchoninsäure (BCA)-Assay beruht auf der Reduktion von Cu2+ zu Cu1+ durch Proteine in einem alkalischen Medium. BCA chelatiert dann das Cu1+ und bildet eine violette Farbe, die bei 562 nm absorbiert. Der BCA-Assay ist gegenüber Detergenzien toleranter als der Bradford-Assay, ist jedoch weniger kompatibel mit Reduktionsmitteln.
Lowry-Assay
Der Lowry-Assay kombiniert die Biuret-Reaktion (Kupferchelatbildung) mit dem Folin-Ciocalteu-Reagenz, das mit Tyrosin- und Tryptophanresten reagiert. Es erzeugt eine blaue Farbe, gemessen bei 750 nm. Es ist empfindlich, erfordert jedoch ein sorgfältiges Timing und wird durch viele störende Substanzen beeinflusst.
UV-Absorption (A280)
Proteine absorbieren UV-Licht bei 280 nm aufgrund von Tryptophan- und Tyrosinresten. Die Absorption bei 280 nm ermöglicht eine schnelle, zerstörungsfreie Schätzung der Proteinkonzentration. Es ist am genauesten für reine Proteine mit bekannten Extinktionskoeffizienten.
Standardkurve
Alle kolorimetrischen Tests erfordern eine Standardkurve. Es werden Reihenverdünnungen eines bekannten Proteinstandards, typischerweise Rinderserumalbumin (BSA), hergestellt und gemessen. Die Absorption der unbekannten Probe wird mit der Standardkurve verglichen, um ihre Konzentration zu berechnen.
Praktische BCA- und Bradford-Assay-Protokolle
BCA-Assay: Bereiten Sie BSA-Standards durch serielle Verdünnung im gleichen Puffer wie die Proben vor – ein typischer Bereich liegt bei 25–2000 µg/ml (0, 25, 125, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000 µg/ml). Mischen Sie 25 µL jedes Standards oder jeder Probe mit 200 µL BCA-Arbeitsreagenz (50:1-Verhältnis von Reagenz A zu Reagenz B) in einer 96-Well-Platte. 30 Minuten bei 37 °C inkubieren. Auf Raumtemperatur abkühlen lassen und Absorption bei 562 nm messen. Passen Sie eine quadratische oder lineare Standardkurve an. Der BCA-Assay ist mit Detergenzien (SDS, Triton X-100) bis zu 5 % kompatibel, jedoch nicht mit Reduktionsmitteln (DTT, β-Mercaptoethanol) > 1 mM. Bradford-Assay: Bereiten Sie Standards im gleichen Bereich vor (25–1000 µg/ml). Mischen Sie 10 µL Standard oder Probe mit 200 µL Bradford-Reagenz (Coomassie G-250-Farbstoff in Phosphorsäure und Methanol). 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Messen Sie die Absorption bei 595 nm. Der Bradford-Assay ist schnell (2 Minuten) und mit Reduktionsmitteln und Chelatbildnern (EDTA) kompatibel, wird jedoch durch Detergenzien (>0,1 % Triton X-100 oder SDS) stark gehemmt. Berücksichtigen Sie bei beiden Tests reine Puffer-Leerproben. Jeder Standard und jede Probe sollte in doppelter oder dreifacher Ausfertigung getestet werden. Messwerte mit CV > 15 % verwerfen. Beheben Sie einen hohen Hintergrund, indem Sie die Probe weiter verdünnen, die Tests wechseln (verwenden Sie Bradford, wenn Proben Reduktionsmittel enthalten, verwenden Sie BCA, wenn Proben Detergenzien enthalten) oder eine TCA/Aceton-Fällung durchführen, um störende Substanzen zu entfernen.
Reale Anwendung
Bei der Quantifizierung von Proteinlysat aus Säugetierzellen, die in RIPA-Puffer (enthaltend 1 % Triton X-100 und 0,1 % SDS) extrahiert wurden, ist der BCA-Assay dem Bradford-Assay vorzuziehen. Die Standardkurve von 25–2000 µg/ml BSA in RIPA-Puffer zeigt R² = 0,996. Das unbekannte Lysat ergibt A562 = 0,45, entsprechend 1250 µg/ml. Nach der Verdünnung werden 20 µg pro Spur für die SDS-PAGE oder für die Analyse mittels Kapillargelelektrophorese geladen.
